Учебно-методическое пособие Дисциплина- «Микробиология»
|
Скачать 2.13 Mb.
|
| ГЛАВА 4 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды для их жизнедеятельности. ПРИНЦИПЫ СОСТАВЛЕНИЯ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах, поэтому питательная среда должна содержать все вещества, необходимые для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Из этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует. Основными компонентами любой питательной среды для культивирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. И именно эти соединения определяют специфичность подавляющего большинства питательных сред. По потребностям в углероде микроорганизмы принято делить на две большие группы - автотрофы и гетеротрофы. Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислоту - соединение, содержащее углерод в наиболее окисленной форме. В соответствии с этим при культивировании автотрофов необходимо обеспечить клетки углекислотой, так как концентрация углекислоты в воздухе не превышает 0,03% и ее поступления в среду за счет диффузии недостаточно для интенсивного роста микроорганизмов. Поэтому в среды для культивирования автотрофов вносят бикарбонат натрия (NаНС  ) или карбонаты, чаще всего углекислый кальций (СаС). В некоторых случаях через среду продувают воздух, искусственно обогащенный 1-5% углекислоты.Потребности гетеротрофных микроорганизмов не могут быть удовлетворены только углекислотой. Для их развития среда должна содержать органические соединения. В зависимости от индивидуальных особенностей микроорганизмы-гетеротрофы способны использовать различные соединения yглepoдa - кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения. При этом потребности некоторых микроорганизмов, например ряда бактерий из семейства Pseudoтonadaceae, могут быть удовлетворены широким набором различных органических веществ, тогда как другие микроорганизмы характеризуются высокой специализацией и способностью использовать лишь немногие соединения углерода, Так, некоторые метанокисляющие бактерии используют только метан и метанол. Вторым основным компонентом питательной среды является источник азота. Азот входит в состав органических веществ клетки главным образом в восстановленной форме - в виде амино(-N  ) или имино(-NН)-групп. Тем не менее потребности микроорганизмов в источнике азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими соединениями, в которых азот имеет разную степень восстановленности. Для очень многих микроорганизмов это могут быть соли аммония. В этом случае в среды вносят N Cl или (N ) S . Следует, однако, помнить, что аммонийные соли – физиологически кислые соли, так как по мере использования иона аммония в среде накапливается анион соответствующей кислоты. Что приводит к заметному возрастанию кислотности среды и может отрицательно повлиять на развитие микроорганизмов. Гидроксид аммония (NН ОH) в качестве источника азота используют редко, пocкoльку он вызывает сильное подщелачивание питательных сред. Потребности значительного числа микроорганизмов в азоте могут быть удовлетворены нитратами. Питательные среды для культивирования таких микроорганизмов содержат КNО  или NaNО. В отличие от солей аммония нитраты - физиологически щелочные соли, так как при использовании аниона NО- в среде накапливаются катионы К+ или Na+. Нитриты в кислых условиях для многих микроорганизмов токсичны, поэтому в качестве источника азота почти не используются.Питательные среды для культивирования микроорганизмов, более требовательных к азоту и соответственно обладающих меньшими биосинтетическими способностями, должны включать одну, несколько или полный набор аминокислот. Отдельные аминокислоты в L- или DL- форме добавляют к стерильной среде в концентрации от 0,1 до 0,05 г на 100 мл непосредственно перед засевом ее микроорганизмами. Для этого рекомендуется использовать растворы аминокислот, в которых концентрация превышает содержание аминокислоты в среде в 100 раз. Глицин, аланин, пролин, лизин и орнитин растворяют в дистиллированной воде, фенилаланин и триптофан - в дистиллированной воде, подщелоченной NaOH, остальные аминокислоты - в дистиллированной воде, подкисленной HCl. Аминокислоты - цистин и цистеин, а также амиды - глутамин и аспарагин неустойчивы к нагреванию, поэтому их стерилизуют фильтрованием. Остальные аминокислоты можно стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин. Потребности микроорганизмов в нескольких аминокислотах часто удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка. Для получения гидролизатов используют белки животного (мясо, рыбу, желатину, казеин) или растительного (семена сои, подсолнечника) происхождения, а также клетки микроорганизмов (дрожжи, водоросли, бактерии). Гидролиз проводят с помощью протеолитических ферментов или кипячением с минеральными кислотами либо с терпкими щелочами. Состав гидролизатов неодинаков и зависит от исходного субстрата, а также способа получения. Чаще других используют гидролизат казеина, который готовят в лабаратории, как правило, кислотным гидролизом. Для этого 20 г казеина заливают 200 мл воды, добавляют 10 мл концентрированной H SOи выдерживают в автоклаве 4 ч при 1,5 атм. Однако при этом подвергается коррозии оборудование автоклава, поэтому чаще гидролизат казеина получают иначе. К 200 г казеина добавляют 280 мл 6н раствора НСl, и смесь кипятят с обратным холодильником 18 ч. Полученный гидролизат нейтрализуют 50%-ным раствором NaOH до рН 7, фильтруют; через бумажный фильтр и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Содержание аминного азота в гидролизате, полученном таким способом, составляет 700 – 1000 мг на 100 мл. Его добавляют к средам в таком количестве, чтобы концентрация по аминному азоту составляла 10-30 мг на 100 мл. Следует иметь в виду, что при кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан, в достаточно большой степени цистеин и незначительно серин и треонин. Имеется готовый препарат гидролизата казеина. Его вносят в среды от 0,1 до 1,0 г на 100 мл в зависимости от потребностей микроорганизмов.Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного расщепления- пептоны. Пептоны представляют собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотных оснований, солей и микроэлементов. Их получают в результате воздействия протеолитических ферментов на белки животного (мышечный белок, казеин) или растительного (соевая мука) происхождения. В отечественных лабораториях чаще всего используют ферментативный пептон, выпускаемый Семипалатинским заводом. Это гигроскопический порошок светло-желтого цвета, полностью растворимый в воде; 1 %-ный раствор пептона имеет нейтральную или слабокислую реакцию. В питательные среды пептон добавляют от 1-2 до 20 г на 1 л. Необходимо иметь в виду, что аминокислоты и пептон микроорганизмы могут использовать не только как источник азота, но и как источник углерода и энергии. Некоторые бактерии способны использовать в качестве единственного источника азота молекулярный азот - N . Это азотфиксаторы. В среды для культивирования таких микроорганизмов соединений азота можно не вносить. Снабжение азотфиксаторов газообразным азотом осуществляется благодаря соприкосновению среды с воздухом или культивированию в атмосфере азота.Помимо источников углерода и азота многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся витамины, пурины, пиримидины и аминокнслоты. Для того чтобы подчеркнуть потребность, микроорганизмов в факторах роста, принято использовать термины «прототрофы» и «ауксотрофы». Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или нескольких факторов роста. Этими терминами особенно широко пользуются в литературе по генетике. Если потребности микроорганизмов в факторах роста ограничены одним или несколькими витаминами, то рекомендуется вносить их в культуральные среды, используя следующие концентрации: тиамин (витамин В  ), пантотенат Са, рибофлавин (витамин B), никотиновая кислота (ниацин), пиридоксин, пиридоксамин, холин, кобаламин (витамин B ) - по 1 мкг на 1 мл среды; фолиевая кислота и n-аминобензойная кислота - по 0,05 мкг на 1 мл среды; биотин - 0,005 мкг на 1 мл среды.Витамины добавляют к стерильной среде непосредственно перед ее засевом. Для этого рекомендуется использовать растворы, в которых концентрация витамина превышает его содержание в питательной среде в 100 раз. Paстворы готовят в стерильной посуде и используют стерильную дистилированную воду. Исключение составляют рибофлавин и фолиевая кислота. Рибофлавин растворяют в 0,02 н уксусной кислоте, а фолиевую кислоту - в 0,01 н NaOH, доводя затем концентрацию NaOH в растворе до 0,001 н. Полученные растворы стерилизуют прогреванием в кипящей водяной бане 3 мин. Раствор тиамина рекомендуется стерилизовать фильтрованием, так как при нагревании тиамин разрушается. При температуре +4 растворы витаминов сохраняются не менее месяца. Растворы фолиевой кислоты. пиридоксина и рибофлавина сохраняют в темноте, так как они светочувствительны. Примерами смесей, содержащих факторы роста, могут служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, а также кукурузный экстракт. Дрожжевой экстракт вносят в среду для культивирования от 0,05 до 0,5 г на 100 мл, дрожжевой автолизат - в таком количестве, чтобы концентрация аминного азота составляла 5-30 мг на 100 мл среды. Дрожжевой экстракт имеется в продаже. Дрожжевой автолизат готовят следующим образом: 40 г свежих прессованных или 10 г сухих дрожжей заливают водой и перемешивают до получения гомогенной массы, затем добавляют несколько кристаллов тимола или 1-2 мл хлороформа и выдерживают в термостате при 50-55 3 суток. За это время клетки дрожжей отмирают, а ферменты остаются активными и гидролизуют белки, а также другие биополимеры. Через 3 суток полученный автолизат после тщательного перемешивания кипятят на слабом огне 20 мин и фильтруют через бумажную пульпу, используя воронку Бюхнера. Содержание аминного азота определяют формальным титрованием. Дрожжевой автолизат стерилизуют при 0,5 атм 15 мин и сохраняют в холодильнике. Кукурузный экстракт - готовый продукт заводов крахмало-паточной промышленности. Он содержит аминокислоты, витамины, достаточно большое количество органических кислот (молочной, уксусной и муравьиной) и минеральные соли. Кукурузный экстракт вносят в среды от 0,5 до 5 г на 10 мл; стерилизуют при 0,5 атм. Кроме источников углерода, азота и факторов роста микроорганизмам для построения веществ клетки необходимы сера, фосфор и ряд других элементов. Все они должны содержаться в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Потребности разных групп микроорганизмов в сере, фосфоре и других зольных элементах удовлетворяются обычно за счет минеральных солей. Поэтому так называемый «минеральный фон» сред для культивирования многих микроорганизмов может быть близким по составу. Так, потребности подавляющего большинства микроорганизмов в сере удовлетворяются сульфатами, хотя в клетке сера находится в основном в восстановленной форме, в виде сульфгидрильных групп. Значительно реже встречаются микроорганизмы, требующие наличия в среде восстановленной серы. В этом случае в среду вносят сульфиды, чаще всего Na S, или органические соединения, содержащие сульфгидрильные группы, например цистеин.Соли фосфорной кислоты удовлетворяют потребности микроорганизмов в фосфоре. Все необходимые металлы - К, Na, Са, Mg, Fe, Мn, Co, Сu - и другие элементы микроорганизмы получают в форме катионов или анионов неорганических солей. Например, источником магния служит MgSO источником натрия и хлора - NaCl, кальция - СаСОили CaCl. Железо добавляют к средам в виде хлорида, сульфата или цитрата.Для того чтобы избежать выпадения осадка в результате образования нерастворимых комплексов фосфатов с некоторыми катионами, особенно с железом и кальцием, к средам рекомендуется добавлять от 0,001 до 1 г/л этилендиаминтeтраацетат (ЭДТА) или гексаметафосфат натрия в концентрации 4 г/л. Комплексы, образуемые этими соединениями с катионами, служат резервом, из которого в результате диссоциации в раствор поступают свободные катионы. Калий, магний, кальций и железо требуются в относительно больших количествах, поэтому их соли, как правило, включают в состав питательных сред. Потребности микроорганизмов в марганце, молибдене, цинке, меди, кобальте очень малы. Эти элементы, часто называемые микроэлементами, вносят в среды от 1 мг дo l мкг на 1 л; более высокие концентрации могут быть токсичны. Питательные среды с пептоном, почвенной вытяжкой, дрожжевым экстрактом, гидролизатом казеина содержат необходимые микроэлементы. В состав синтетических сред, которые готовятся на дистиллированной воде, их следует вносить. Об оптимальных концентрациях микроэлементов для разных микроорганизмов известно мало, поэтому предложены различные по составу смеси микроэлементов. Смесь микроэлементов по Дрюсу (Drews, 1976), мг: ЭДТА Na-800; MnCl *4HO-10; CoCl*6HO-4; CuSO-1; NaMoO*2НО - 3;ZnCl-2; LiCl - 0,5; SnCl*2H0;- 0,5; НВО- 1, КВг-2; KJ -2; BaCl-0,5; вода дистиллированная-1000 мл; рН 6,0. На 1 л среды добавляют от 5 до 10 мл этого раствора.Cмесь микроэлементов по Пфеннигу (Pfennig, 1965), мг: ЭДТА-500; FeSO *7 HO-200; ZnSO*7 HО-10; МnСl.4 HО-3; НВО-30; CoCl*2 HO - 20; CuCl*2 HO - 1; NiCl*6 HO - 2; NaMoO*2 HО - 3; вода дистилированная - 1000 мл. На 1 л среды добавляют от 1 до 10 мл этого раствора. Растворы микроэлементов рекомендуется стерилизовать отдельно и вносить в среду непосредственно перед ее засевом.Питательные среды для культивирования микроорганизмов кроме соединений, необходимых для процессов биосинтеза, должны включать и энергетический материал. По способу получения энергии все микроорганизмы принято делить на две основные группы: хемотрофы и фототрофы. Хемотрофы используют энергию окисления различных соединений. В зависимости от окисляемого субстрата (донора водорода) среди хемотрофных организмов выделяют хемолитотрофы и хемоорганотрофы. Первые окисляют неорганические соединения, такие как H S, S или другие не вполне окисленные соединения серы, H, NH+, NO- или Fe . Эти соединения в средах для культивирования хемолитотрофных бактерий выполняют прежде всего функцию энергетического материала. Для хемоорганотрофов энергетическим субстратом служат органические вещества, которые обычно играют двоякую роль, являясь одновременно и источником углерода и источником энергии. Однако есть микроорганизмы, которые для конструктивных и энергетических процессов нуждаются в разных соединениях. Например, гомоферментативные молочнокислые бактерии получают энергию при сбраживании сахаров, но почти не используют их в процессах биосинтеза. Для конструктивных целей им необходимы готовые аминокислоты, пуриновые или пиримидиновые основания, витамины.Фототрофы используют энергию света. Чтобы удовлетворить потребности этих бактерий в энергии, их культивируют при дневном или искусственном освещении. По составу принято выделять естественные или натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды. |
Похожие:
 |
Учебно-методическое пособие Казань 2010 Печатается по рекомендации... Учебно-методическое пособие по курсу «Организационное поведение» /Д. М. Сафина. – Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет;... |
|
Учебно-методическое пособие санкт-Петербург 2009г. Автор: Г. П. Подвигин... Учебно-методическое пособие предназначено для должностных лиц, специалистов го и рсчс организаций |
|
Учебно-методическое пособие тверь 2015 удк 339. 543(075. 8) Ббк у428-861.... С 47 Таможенные платежи: учебно-методическое пособие. – Тверь: Твер гос ун-т, 2015. – 155 с |
|
Учебно-методическое пособие по курсу «Рентгенографический анализ» Казань, 2010 Методическое пособие предназначено для студентов и аспирантов геологического факультета |
|
Учебно-методическое пособие Рекомендовано методической комиссией... Учебно-методическое пособие предназначено для организации активной самостоятельной работы студентов над учебным материалом при изучении... |
|
Учебно-методическое пособие по обучению профессионально-ориентированному чтению Учебно-методическое пособие по обучению профессионально-ориентированному чтению студентов специальности «Автоматика, телемеханика... |
|
Вихретоковый метод контроля учебно-методическое пособие Вихретоковый метод контроля : учебно-методическое пособие / Е. А. Копотун, А. В. Челохьян, Б. Е. Копотун; Рост гос ун-т путей сообщения.... |
|
Учебно-методическое пособие для семинарских занятий (Практикум) Учебно-методическое пособие предназначено для проведения теоретических семинаров и практических занятий со студентами, обучающимися... |
|
Учебно-методическое пособие нормы современного русского литературного... Легкая Н. М. Нормы современного русского литературного языка. Учебно- методическое пособие для студентов средних специальных учебных... |
|
Римское право и латинская юридическая терминология Учебно-методическое пособие Учебно-методическое пособие предназначено для оказания методической помощи студентам тф ноу впо «Росноу» в изучении курса «Римское... |
|
Учебно-методическое пособие по самостоятельной работе и выполнению... Учебно-методическое пособие предназначено для обучающихся 2-го курса магистерской программы по направлению подготовки 38. 04. 04... |
 |
Учебно-методическое пособие для выполнения дипломной работы по специальности... Учебно-методическое пособие предназначено для преподавателей и студентов, занимающихся выполнением выпускной квалификационной работы... |
|
Учебно-методическое пособие для студентов лечебного, педиатрического,... Учебно-методическое пособие предназначено для студентов лечебного, педиатрического, медико-профилактического факультетов и может... |
|
Учебно-методическое пособие по сопровождению самостоятельной работы... Учебно-методическое пособие предназначено для обучающихся автодорожного техникума, как руководство для организации самостоятельной... |
|
Учебно-методическое пособие Санкт-Петербург 2007 Автор: Черемисов... Учебно-методическое пособие предназначено для подготовки руководящего состава, специалистов гочс и пб, руководителей служб, аварийно-спасательных... |
|
Учебно-методическое пособие прежде всего инструмент. Значит, к нему... Валютное регулирование в Российской Федерации: правила, контроль, ответственность: Учебно-практическое пособие |