МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО КОНТРОЛЮ КАЧЕСТВА ВЕТЕРИНАРНОЙ ДЕЗИНФЕКЦИИ ОБЪЕКТОВ ЖИВОТНОВОДСТВА
1. Общая часть
1.1. Настоящие методические указания определяют порядок и методы контроля качества профилактической и вынужденной (текущей и заключительной) дезинфекции объектов, подлежащих ветеринарному надзору.
1.2. Методические указания предназначены для специалистов ветеринарных лабораторий, а также лабораторий хозяйств, дезинфекционно-промывочной станции (ДПС) и предприятий по производству и переработке мяса и сырья животного происхождения.
1.3. Контроль качества проводят в три этапа:
1.3.1. Контроль подготовки объектов к дезинфекции (проверяют степень очистки поверхностей, их увлажненность, защиту электрооборудования и приборов, герметизацию помещений) осуществляет ветеринарный специалист, ответственный за ее проведение.
1.3.2. Контроль за соблюдением установленных режимов дезинфекции (выбор препарата и метода дезинфекции, концентрация, температура раствора, равномерность увлажнения поверхностей дезинфицирующим раствором, соблюдение параметров производительности используемых машин и аппаратов, качество распыления раствора) проводит ветеринарный специалист, ответственный за это мероприятие.
1.3.3. Бактериологический контроль качества дезинфекции осуществляют специалисты ветеринарных лабораторий периодически или в сроки, установленные с учетом эпизоотической обстановки, технологии производства, целей дезинфекции и других конкретных особенностей.
1.3.3.1. Бактериологический контроль качества дезинфекции должен быть неожиданным, без предварительного уведомления работников, ответственных за проведение дезинфекции, и исполнителей этих работ о времени и месте отбора проб для исследования.
1.3.3.2. При бактериологическом контроле качества дезинфекции определяют наличие на поверхностях обеззараживаемых объектов жизнеспособных клеток санитарно-показательных микроорганизмов - бактерий группы кишечной палочки (Escherichia, Citrobacter, Enterobacter), стафилококков (aureus, epidermatis, saprophiticus), микобактерий или спорообразующих аэробов рода Bacillus.
Качество обеззараживания спецодежды контролируют по выделению тест-микроорганизмов на искусственно контаминированных кусочках ткани, закладываемых в подлежащий обеззараживанию материал.
1.3.3.3. По наличию или отсутствию бактерий группы кишечной палочки определяют качество профилактической и вынужденной (текущей и заключительной) дезинфекции при бруцеллезе, колибактериозе, лептоспирозе, листериозе, болезни Ауески, лейкозе, пастереллезе, сальмонеллезах, трихомонозе, кампилобактериозе, трипанозомозе, токсоплазмозе, инфекционном ринотрахеите, парагриппе и вирусной диарее крупного рогатого скота, контагиозной эктиме, инфекционной агалактии и контагиозной плевропневмонии овец и коз, отечной болезни, инфекционном атрофическом рините, дизентерии, трансмиссивном гастроэнтерите, балантидиозе, гемофилезной плевропневмонии и роже свиней, ринопневмонии лошадей, пуллорозе-тифе птиц, миксоматозе кроликов, микоплазмозе птицы, а также текущей дезинфекции при болезнях, указанных в п. 1.3.3.4 (кроме туберкулеза, споровых и экзотических инфекций).
1.3.3.4. По наличию или отсутствию стафилококков контролируют качество текущей дезинфекции при туберкулезе, болезнях, вызываемых спорообразующими микроорганизмами, и экзотических инфекциях; заключительной дезинфекции при туберкулезе, аденовирусных инфекциях, ящуре, оспе, туляремии, орнитозе (пситтакозе), диплококкозе, стафилококкозе, стрептококкозе, некробактериозе, катаральной лихорадке, бешенстве, чуме всех видов животных, злокачественной катаральной горячке, ринопневмонии и паратуберкулезном энтерите крупного рогатого скота, инфекционной катаральной лихорадке, копытной гнили и инфекционном мастите овец, везикулярной болезни свиней, инфекционной анемии, инфекционном энцефаломиелите, эпизоотическом лимфангоите, сапе и мыте лошадей, гепатите утят, вирусном энтерите гусят, инфекционном бронхите, ларинготрахеите, болезни Марека, болезни Гамборо, инфекционном энцефаломиелите, ньюкаслской болезни, вирусном энтерите, алеутской болезни, псевдомонозе и инфекционном гепатите плотоядных, хламидиозах, риккетсиозах, энтеровирусных инфекциях, гриппе сельскохозяйственных животных и птицы, трихофитии, микроспории, других микозах животных и птицы, актиномикозе крупного рогатого скота, а также болезнях, вызываемых неклассифицированными вирусами, и дезинфекции вагонов второй категории.
Качество заключительной дезинфекции при микозах контролируют также по выделению соответствующих возбудителей.
1.3.3.5. Качество заключительной дезинфекции при туберкулезе контролируют по выделению стафилококков и микобактерий, при сибирской язве, эмфизематозном карбункуле, брадзоте, злокачественном отеке, других споровых инфекциях и экзотических инфекциях, а также вагонов третьей категории - по наличию или отсутствию спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus.
2. Отбор проб для исследования
2.1. Отбирают пробы для бактериологического контроля и доставляют их в лабораторию специалисты, не несущие ответственности за качество дезинфекции и не находящиеся в подчинении работников, ответственных за ее проведение.
2.2. Отбор проб проводят по истечении срока экспозиции, указанного в соответствующих разделах настоящей инструкции, до начала проветривания помещений; при дезинфекции спецодежды - по окончании цикла обработки (обеззараживания, стирки, ополаскивания и отжима).
2.3. Пробы (смывы, отпечатки, соскобы) для исследования берут с 10 - 20 различных участков поверхности животноводческого помещения (полов, стойл, проходов, стен, перегородок, столбов, кормушек, поилок и т.д.). При наличии на объекте участков поверхности с механическими загрязнениями пробы материала для исследования берут методом соскобов.
При контроле качества дезинфекции других объектов ветеринарного надзора пробы берут с 10 - 20 различных наименее доступных для дезинфекции участков поверхностей каждого помещения.
2.3.1. Для контроля качества дезинфекции при туберкулезе с каждого вида поверхности берут по пять смывов, которые объединяют в одну пробу. Из каждого помещения отбирают не менее 10 объединенных проб, в том числе по три пробы с пола и кормушек.
При заключительной дезинфекции одновременно берут пробы с территории фермы в разных направлениях от углов здания и от центра каждой стены на расстоянии 5, 10 и 15 м (с учетом рельефа местности). Всего с прилегающей территории отбирают не менее 24 проб. Поверхностный слой грунта разрыхляют стерильным скальпелем или ножом на глубину 3 - 5 см и отбирают в стерильную посуду 10 - 20 г исследуемого материала. Если прилегающая территория имеет твердое покрытие, пробы отбирают методом смывов.
2.4. После проведения дезинфекции и последующей экспозиции с участков, подвергаемых контролю, отбирают пробы стерильными ватно-марлевыми тампонами, смоченными в стерильном нейтрализующем растворе или воде.
Участки площадью 10 х 10 см тщательно протирают до полного снятия с поверхности всех имеющихся на ней загрязнений, после чего тампоны помещают в пробирку с нейтрализующей жидкостью.
Плотные загрязнения (корочки) снимают с помощью стерильного скальпеля и переносят в эту же пробирку.
Для нейтрализации хлорсодержащих дезинфицирующих средств служит раствор тиосульфата натрия (гипосульфита), щелочных растворов - раствор уксусной кислоты; формалина - раствор аммиака (нашатырный спирт); кислот, перекиси водорода и ее производных - раствор бикарбоната натрия.
При использовании для дезинфекции щелочного раствора формальдегида участки сначала увлажняют раствором аммиака, затем дополнительно раствором уксусной кислоты.
При дезинфекции препаратами, для которых нет нейтрализаторов, применяют стерильную водопроводную воду.
2.5. Отпечатки на тонкий слой плотной питательной среды берут лица, прошедшие специальную подготовку.
Предметные стекла с нанесенной средой (п. 9 Приложения 3) извлекают корнцангом из ванн или пробирок, не касаясь застывшей питательной среды, и накладывают на исследуемый объект таким образом, чтобы питательная среда соприкасалась с его поверхностью. Через 2 мин. пробы-отпечатки отделяют от контролируемого объекта и помещают в ванны или пробирки, в которых их транспортировали. При взятии проб с труднодоступных или вертикальных поверхностей время контакта слоя питательной среды с объектом сокращают до 30 с.
2.6. Смывы должны быть доставлены в лабораторию в течение 3 - 6 ч с момента взятия, отпечатки - не позднее 2 ч.
3. Контроль качества дезинфекции помещений
3.1. Метод бактериологического исследования смывов.
3.1.1. Пробы, каждую в отдельности, отмывают в той же пробирке путем нескольких погружений и отжатий тампона. Последний удаляют, а жидкость центрифугируют 20 - 30 мин. при 3000 - 3500 об./мин. Затем надосадочную жидкость сливают, в пробирку наливают такое же количество стерильной воды, содержимое смешивают и снова центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а из центрифугата делают посевы.
При наличии в смыве грубых механических примесей их растирают в пробирке стеклянной палочкой, после чего смыв переносят в центрифужную пробирку.
3.1.2. Для индикации кишечной палочки 0,5 мл центрифугата высевают в пробирки с модифицированной средой Хейфеца или КОДА (п. 11.1). Посевы выдерживают 12 - 18 ч в термостате при температуре 37 - 38 °С. Изменение сиренево-красного цвета сред (в зеленый или салатовый) с помутнением их и образованием газа свидетельствует о наличии роста кишечной палочки.
Другие изменения цвета (желтоватый, розовый, сероватый), наблюдаемые при росте микроорганизмов других видов, не учитывают.
В сомнительных случаях делают подтверждающий посев с жидких сред на агар Эндо. Посевы инкубируют 12 - 16 ч при температуре 37 - 38 °С.
3.1.3. Для индикации стафилококков 0,5 мл центрифугата высевают в 5 мл мясопептонного бульона с 6,5% хлористого натрия. Через 24 - 48 ч инкубирования посевов при температуре 37 - 38 °С делают пересевы бактериологической петлей на 8,5%-ный солевой мясопептонный агар. Посевы выдерживают в термостате 24 - 48 ч при температуре 37 - 38 °С. Из выросших культур для подтверждения роста стафилококков готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.
3.1.4. Для индикации спорообразующих аэробов смывы обрабатывают, как указано в п. 3.1.1 Приложения 3, но перед центрифугированием их прогревают 30 мин. на водяной бане при 65 °С, затем центрифугируют. Из центрифугата каждой пробы делают посевы в одну пробирку с мясопептонным бульоном (МПБ) и на две чашки с мясопептонным агаром (МПА). Для контроля качества дезинфекции при сибирской язве МПА может быть заменен дифференциально-диагностической средой (п. 11.3 Приложения 3). Посевы инкубируют 24 - 48 ч в термостате при 37 °С.
При наличии роста на МПА подсчитывают колонии и изучают морфологию их при малом увеличении микроскопа. В случае возникновения подозрения на выделение возбудителя сибирской язвы идентификацию такой культуры проводят в порядке, предусмотренном действующими методическими указаниями.
При наличии роста на дифференциально-диагностической среде в крышку чашки Петри вносят 1 - 2 мл культуры при 20 +/- 20 °С в течение 1 мин., после чего визуально или под малым увеличением микроскопа проводят учет теста.
Под действием паров аммиака происходит порозовение колоний микроорганизмов, обладающих фосфатазной активностью.
Bac. anthracis фосфатазной активностью не обладают и его колонии остаются бесцветными.
При отсутствии роста или характерных колоний на плотных средах и наличии роста в МПБ делают дробные посевы из МПБ на плотную питательную среду.
3.1.5. При просмотре посевов учитывают общее число проб, в которых обнаружен рост санитарно-показательных микроорганизмов, а при споровой инфекции - и колонии непатогенных спорообразующих аэробов рода Bacillus.
3.2. Метод отпечатков на тонкий слой плотной питательной среды.
3.2.1. Метод отпечатков наиболее приемлем в условиях промышленного ведения животноводства на комплексах, птицефабриках и других объектах, где имеются лаборатории.
3.2.2. Ванны и пробирки с пробами-отпечатками, доставленные в лабораторию, помещают на 16 - 18 ч в термостат при температуре 37 °С.
3.2.3. После инкубирования пробы просматривают невооруженным глазом на наличие роста.
При отсутствии макроколоний и изменения среды пробы дальнейшим исследованиям не подвергают. В сомнительных случаях, когда отсутствует рост макроколоний, но изменены цвет или прозрачность среды, пробы-отпечатки высушивают на воздухе до полного подсыхания среды, фиксируют над пламенем, окрашивают по Муромцеву и микроскопируют с целью обнаружения микроколоний.
3.2.4. Учитывают общее число отпечатков, в которых обнаружен рост микроорганизмов.
3.3. Исследование с целью выделения микобактерий.
3.3.1. Контроль качества заключительной дезинфекции при туберкулезе проводят параллельно двумя методами по выделению стафилококка и микобактерий.
3.3.2. Смывы обрабатывают, как указано в п. 3.1.1. Из центрифугата каждой объединенной пробы делают высев на среды для выделения стафилококков (п. 3.1.3), готовят по шесть мазков на узких (1,2 х 7,5 см) предметных стеклах (п. 10 Приложения 3). Мазки высушивают при комнатной температуре или в термостате 2 - 3 ч, складывают их по два тыльной стороной и погружают в 8 - 12%-ный раствор серной кислоты на 15 мин. После этого стекла-мазки берут пинцетом и погружают на 5 - 10 с в стерильную дистиллированную воду, а затем переносят в пробирки со средой Сотона и помещают на 12 суток в термостат при 37 - 38 °С.
3.3.3. Пробы почвы с прилегающей территории и соскобов с поверхности помещений (каждую в отдельности) помещают в колбу, заливают дву-трехкратным количеством дистиллированной воды, взбалтывают и фильтруют через двойной слой марли в узкогорлую колбу вместимостью 200 - 250 мл. К фильтрату добавляют 2 - 3 мл ксилола или авиационного бензина, встряхивают 15 - 20 мин. и доливают дистиллированную воду до горлышка. Содержимое отстаивают 30 мин. с целью получения флотата, из которого готовят мазки на узких предметных стеклах (п. 3.3.2).
3.3.4. При наличии роста стафилококков хотя бы в одной исследованной пробе качество дезинфекции признают неудовлетворительным и дальнейшее исследование по выделению микобактерий не проводят.
3.3.5. Стекла с мазками извлекают из пробирок на 6-й, 8-й и 12-й день инкубирования, высушивают, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают по Циль-Нильсену и микроскопируют для обнаружения микроколоний.
3.4. Оценка результатов исследования.
3.4.1. Качество профилактической дезинфекции помещений для получения и содержания молодняка скота (птицы) и текущей дезинфекции изолированных секций (боксов, скотных дворов) с автономной системой жизнеобеспечения животных признают удовлетворительным при отсутствии роста санитарно-показательных микроорганизмов в 90% исследованных проб.
При профилактической дезинфекции помещений для содержания взрослого поголовья и текущей дезинфекции частично освобожденных от животных или неизолированных помещений допускается выделение санитарно-показательных микроорганизмов из 20% исследованных проб.
3.4.2. Качество заключительной дезинфекции при ее контроле по выделению бактерий группы кишечной палочки, стафилококков, грибов и микобактерий признают удовлетворительным при отсутствии выделения названных культур во всех исследованных пробах.
При споровых инфекциях качество дезинфекции признают удовлетворительным при отсутствии роста Bac. anthracis. При прямом посеве на МПА допускают рост единичных (не более трех в смыве) колоний непатогенных спорообразующих аэробов рода Bacillus.
4. Контроль качества профилактической аэрозольной дезинфекции, проводимой формалином
4.1. Метод предназначен для быстрого (непосредственно после окончания экспозиции дезинфекции) контроля качества аэрозольной дезинфекции животноводческих помещений, проводимой формалином.
4.2. Метод основан на окрашивании индикаторной среды под воздействием газовой и капельной фаз аэрозоля формальдегида. В качестве индикатора используют среду Эндо, которая под воздействием формальдегида в процессе аэрозольной дезинфекции приобретает резко очерченное красное окрашивание.
4.3. Перед проведением дезинфекции индикаторные пробирки (п. 12) размещают на полу, стенах и потолке помещения и на находящемся в нем оборудовании. Особо важно прикрепить индикаторные пробирки с помощью пластилина, липкой ленты или других средств в труднодоступных местах (внутри оборудования, у щелей и т.д.). На одно помещение требуется в среднем 10 - 15 пробирок.
Перед размещением с пробирок снимают парафиновые колпачки. На полу помещения пробирки устанавливают, а на стенах прикрепляют открытым концом вверх, на потолке фиксируют открытым концом вниз.
4.4. Оценку качества дезинфекции проводят непосредственно после окончания экспозиции (12 или 24 ч). Линейкой с миллиметровой шкалой измеряют длину окрашенного столбика индикаторной среды, начиная с обреза пробирки. Дезинфекцию считают удовлетворительной, если глубина окрашивания среды после экспозиции 12 ч составляет не менее 18 мм, а после экспозиции 24 ч - 30 мм.
5. Контроль качества дезинфекции спецодежды
5.1. Качество дезинфекции спецодежды, мешкотары и прочих изделий из тканевых материалов, подвергаемых обеззараживанию в камерах, методом замачивания в дезинфицирующем растворе, кипячением или по режимам одновременной стирки и дезинфекции, контролируют по выделению тест-культур микроорганизмов из тест-объектов, закладываемых в подлежащий обеззараживанию материал.
5.2. При контроле качества дезинфекции в очагах бактериальных (кроме туберкулеза) и вирусных инфекций в качестве тест-культуры используют музейные штаммы кишечной палочки, в очагах туберкулеза и малоизученных вирусных инфекций - золотистого стафилококка, в очагах споровых инфекций - Bac. cereus.
5.3. В качестве тест-объектов используют кусочки батистовой ткани, импрегнированные соответствующей тест-культурой (п. 7 Приложения 3).
5.4. Тест-объекты (по 2 шт.) закладывают в стерильные мешочки размером 5 х 8 см, изготовленные в виде конверта из той же ткани, что и подлежащие обеззараживанию изделия. Мешочки с вложенными в них тест-объектами помещают в карман спецодежды или пришивают нитками к подлежащим обеззараживанию изделиям.
При дезинфекции (методом замачивания в дезинфицирующих растворах или кипячением) изделия с заложенными в них тест-объектами размещают послойно в низу, в середине и в верхней части емкости, а при обеззараживании в камере - в разных местах ее.
5.5. По истечении экспозиции дезинфекции или цикла стирка - отполаскивание - отжим при использовании метода одновременного обеззараживания и стирки мешочки с тест-объектами помещают в стерильные чашки Петри и доставляют в лабораторию для исследования.
В лаборатории после извлечения из мешочка каждый тест-объект промывают 5 мин. в растворе соответствующего нейтрализатора (п. 2.4 Приложения 3) и стерильной водопроводной воде (или дважды в воде, если нейтрализатор неизвестен) и помещают в пробирку с соответствующей питательной средой. Если дезинфекцию проводили методом кипячения без добавления кальцинированной соды, дополнительного промывания тест-объектов не требуется.
5.6. При контроле качества дезинфекции по выделению кишечной палочки посев проводят в модифицированную среду Хейфеца или КОДА, для выделения стафилококка - в солевой МПБ, для выделения Bac. cereus - в МПБ (пп. 3.1.2 - 3.1.4 Приложения 3).
5.7. Качество дезинфекции признают удовлетворительным при отсутствии роста тест-культуры во всех пробах.
6. Методы определения содержания действующего вещества в дезинфицирующих средствах и их растворах
6.1. Определение массовой доли натра едкого в препарате и его растворах.
6.1.1. Аппаратура, реактивы и растворы.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-88 с наибольшим пределом взвешивания 500 г, третьего класса точности.
Колба (ГОСТ 1770-74) исполнения 1 или 3 вместимостью 500 куб. см.
Пипетки (ГОСТ 29169-91) вместимостью 20 и 25 куб. см.
Бюретка (ГОСТ 20292-74) вместимостью 50 куб. см, ценой деления 0,1 куб. см.
Кислота соляная (ГОСТ 3118-77), химически чистая (х.ч.) или чистая для анализа (ч.д.а.), раствор концентрации 1 моль/куб. дм.
Барий хлористый (ГОСТ 4108-72), х.ч. или ч.д.а., 10%-ный раствор, предварительно нейтрализованный по фенолфталеину.
Фенолфталеин (ГФХ, стр. 830), 1%-ный спиртовый раствор.
Вода дистиллированная, не содержащая CO (ГОСТ 6709-72).
2
6.1.2. Подготовка к анализу.
6.1.2.1. Приготовление анализируемого раствора твердого препарата.
Перед взятием навески с пробы препарата удаляют верхний выветрившийся слой. В стаканчик для взвешивания быстро отбирают около 20 г препарата и взвешивают. Навеску переносят в мерную колбу, приливают 300 - 400 куб. см воды, растворяют, охлаждают, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (раствор А).
6.1.2.2. Приготовление анализируемого раствора жидкого препарата.
25 куб. см препарата отбирают в предварительно взвешенный стакан вместимостью 100 куб. см, взвешивают, количественно переносят в мерную колбу, разбавляют водой до метки и перемешивают (раствор Б).
Растворы А и Б готовят из двух параллельных навесок.
6.1.3. Проведение анализа.
25 куб. см раствора А и Б помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 20 куб. см раствора хлористого бария, перемешивают и закрывают пробкой. Через 5 мин. вводят две-три капли раствора фенолфталеина и титруют раствором соляной кислоты до обесцвечивания индикатора.
6.1.4. Обработка результатов.
Массовую долю натра едкого (Х) в процентах вычисляют по формуле:
V х 0,04 х 500 х 100
Х = --------------------,
25m
где:
V - объем раствора соляной кислоты, израсходованный на титрование, куб. см;
m - масса навески, взятой для приготовления растворов А и Б, г;
0,04 - масса натра едкого, соответствующая 1 куб. см раствора соляной кислоты, г.
За результат анализа принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не превышают 0,2%.
6.2. Определение содержания формальдегида в формалине техническом, параформе и их растворах.
6.2.1. Реактивы и растворы.
Кислота соляная (ГОСТ 3118-77), ч.д.а., или кислота серная (ГОСТ 4204-77), ч.д.а., растворы концентрации 1 и 0,1 моль/куб. дм.
Натрия гидроокись (ГОСТ 4328-77), ч.д.а., раствор концентрации 0,1 моль/куб. дм.
Натрий сернокислый - сульфит натрия (ГОСТ 195-77 или ГОСТ 429-76), ч.д.а., раствор безводного сульфита натрия 126 г или кристаллического 252 г растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 куб. дм с последующим тщательным перемешиванием.
Тимолфталеин, ГФХ, стр. 828, 0,2%-ный раствор.
Вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72).
6.2.2. Проведение анализа.
1,5 - 1,8 г формалина или 0,5 - 0,6 г параформа взвешивают в колбе с пробкой, содержащей 10 куб. см дистиллированной воды, результат взвешивания записывают до четвертого десятичного знака. При определении содержания формальдегида в рабочих растворах для исследования берут 5 - 25 куб. см формалина или параформа в зависимости от предполагаемой их концентрации. К полученному раствору прибавляют две капли тимолфталеина и нейтрализуют раствором соляной или серной кислоты концентрации 0,1 моль/куб. дм до исчезновения голубой окраски или раствором гидроокиси натрия до появления бледно-голубой окраски.
Нейтральный раствор сульфита натрия переливают в колбу с навеской, перемешивают в течение 2 мин. и титруют раствором соляной или серной кислоты концентрации 1 моль/куб. дм до исчезновения голубой окраски.
6.2.3. Обработка результатов.
Массовую долю формальдегида (Х) в процентах вычисляют по формуле:
V х 0,03003 х 100
Х = -----------------,
m
где:
V - объем раствора соляной или серной кислоты концентрации точно 1 моль/куб. дм, израсходованный на титрование, куб. см;
0,03003 - масса формальдегида, соответствующая 1 куб. см раствора соляной или серной кислоты концентрации 1 моль/куб. дм, г;
m - масса анализируемой пробы, г.
За результат анализа принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не превышают 0,2%.
Результат округляют до первого десятичного знака.
6.3. Определение массовой доли углекислого натрия в кальцинированной соде (технической).
6.3.1. Реактивы и растворы.
Кислота серная (ГОСТ 4204-77), раствор в концентрации 1 моль/куб. дм.
Метиловый оранжевый (индикатор), 0,1%-ный водный раствор.
Вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72).
6.3.2. Проведение анализа.
Взвешивают 2,3 - 2,5 г кальцинированной соды прокаленной при 270 - 300 °С до постоянной массы, помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, растворяют в 20 куб. см и титруют раствором серной кислоты в присутствии метилового оранжевого до изменения окраски раствора из желтой в оранжево-розовую.
6.3.3. Обработка результатов.
Массовую долю углекислого натрия (Х) в процентах вычисляют по формуле:
V х 0,05299 х 100
Х = -----------------,
m
где:
V - объем раствора серной кислоты концентрации 1 моль/куб. дм, израсходованный на титрование, куб. см;
0,05299 - масса углекислого натрия, соответствующая 1 куб. см раствора серной кислоты концентрации 1 моль/куб. дм;
m - масса навески кальцинированной соды, г.
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 0,2%.
6.4. Определение массовой доли перекиси водорода в препарате и его растворах.
6.4.1. Реактивы и растворы.
Калий марганцево-кислый (ГОСТ 20490-76), х.ч., 0,1 н раствор.
Серная кислота (ГОСТ 4204-77), х.ч., раствор 1:4.
Вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72).
6.4.2. Проведение анализа.
0,15 - 0,20 г перекиси водорода или 1 - 2 мл рабочего раствора, взятые с погрешностью не более 0,0002 г (или 0,01 мл), помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см. Вносят 25 куб. см воды, 20 куб. см серной кислоты и титруют раствором марганцево-кислого калия до розовой окраски, не исчезающей в течение 1 мин.
Одновременно проводят контрольный опыт в тех же условиях и с тем же количеством реактивов, но без анализируемого препарата.
6.4.3. Обработка результатов.
Массовую долю перекиси водорода (Х) в процентах вычисляют по формуле:
(V - V ) х 0,0017
1
Х = ----------------- х 100,
m
где:
V - объем 0,1 н раствора марганцево-кислого калия, израсходованный на
титрование анализируемого раствора, куб. см;
V - объем 0,1 н раствора марганцево-кислого калия, израсходованный
1
на титрование контрольного опыта, куб. см;
0,0017 - масса перекиси водорода, соответствующая 1 куб. см 0,1 н
раствора марганцево-кислого калия, г;
m - масса навески (г) или объем раствора (мл), взятых для анализа.
За результат анализа принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 0,1%.
6.5. Определение массовой доли глутарового альдегида в препарате и его растворах.
6.5.1. Реактивы и растворы.
Пиросульфит натрия - Na S O (ГОСТ 10575-76).
2 2 2
Йод (ГОСТ 4159-79) 0,1 н раствор.
Вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72).
Раствор бисульфита натрия (NaHSO ) готовят путем растворения в воде
3
пиросульфита натрия из расчета 4 г Na S O на 1 куб. дм воды. Пиросульфит
2 2 2
натрия взвешивают и растворяют в дистиллированной воде при тщательном
перемешивании. Хранят в посуде, плотно закрытой пробкой.
6.5.2. Проведение анализа.
В три конические колбы мерной пипеткой вносят 25 куб. см раствора бисульфита натрия, закрывают их притертыми пробками. Затем в колбы с бисульфитом натрия добавляют пробы анализируемого раствора глутарового альдегида (содержание около 0,025 г глутарового альдегида), взвешенные на аналитических весах с погрешностью не более 0,0002 г. Колбы оставляют при комнатной температуре на 30 мин., после чего непрореагировавший бисульфит натрия оттитровывают 0,1 н раствором йода до появления желтой окраски раствора.
Параллельно с рабочим проводят контрольный опыт, для чего в три конические колбы вносят по 25 куб. см раствора бисульфита натрия и оттитровывают их 0,1 н раствором йода до появления желтого окрашивания. Ввиду большой смачиваемости стенок бюретки раствором йода (во избежание большой ошибки) титрование ведут при одинаковой скорости раствора йода во время рабочего и контрольного определений.
6.5.3. Обработка результатов анализа.
Массовую долю глутарового альдегида определяют по формуле:
25 х N х К (V - V) х 100 0,25 х К х (V - V)
и и
Х = ------------------------- = -------------------,
1000 х m m
где:
Х - массовая доля глутарового альдегида, %;
m - навеска раствора глутарового альдегида, г;
N - нормальность водного раствора йода;
К - поправочный коэффициент к титру раствора йода;
V - объем раствора йода, пошедшего на титрование 25 куб. см раствора
и
бисульфита натрия (контрольной пробы), куб. см;
V - объем раствора йода, пошедший на титрование рабочей пробы, куб. см.
За результат анализа принимают среднее арифметическое трех определений, расхождение между максимальным и минимальным значениями которых не должно превышать 3%.
6.6. Определение массовой доли активного хлора в препаратах и их растворах.
6.6.1. Реактивы и растворы.
Вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72).
Калий йодистый (ГОСТ 4232-74), 10%-ный раствор.
Кислота серная (ГОСТ 4204-77), 5%-ный раствор.
Крахмал растворимый (ГОСТ 10163-76), 1%-ный раствор.
Натрий серноватистокислый (тиосульфат натрия) по стандарту СЭВ 223-75, 0,1 н раствор.
6.6.2. Определение массовой доли активного хлора в хлорной извести, кальция гипохлорите нейтральном и в натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты.
1 - 1,5 г натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты (кальция гипохлорита нейтрального) или 2,2 - 2,8 г хлорной извести взвешивают с погрешностью не более 0,0002 г, переносят в фарфоровую ступку, добавляют 30 - 40 куб. см воды и растирают пестиком до образования однородной массы.
После отстаивания водный слой декантируют в мерную колбу вместимостью 500 куб. см. К остатку в ступке добавляют около 20 куб. см воды, тщательно растирают и переносят всю массу в ту же колбу. В случае исследования натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты навеску сразу переносят в мерную колбу. Объем жидкости в колбе доводят до метки водой, тщательно перемешивают и, не давая осадку осесть, отбирают пипеткой 50 куб. см раствора в коническую колбу вместимостью 500 куб. см. В эту же колбу вносят 10 куб. см раствора йодистого калия, перемешивают, прибавляют 50 куб. см раствора серной кислоты, закрывают колбу пробкой, снова перемешивают и помещают в темное место. Через 5 мин. выделившийся йод титруют раствором серноватистокислого натрия до соломенно-желтого цвета, добавляя 1 - 2 куб. см раствора крахмала и продолжают титрование до обесцвечивания раствора.
6.6.3. Определение массовой доли активного хлора в растворах вышеуказанных препаратов (п. 6.6.2) и гипохлорита натрия.
10 куб. см раствора отбирают пипеткой и переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают.
10 куб. см приготовленного раствора переносят пипеткой в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 10 куб. см йодистого калия и 20 куб. см серной кислоты, перемешивают, закрывают колбу пробкой и ставят в темное место.
Через 5 мин. титруют выделившийся йод до обесцвечивания раствора.
6.6.4. Обработка результатов.
Массовую долю активного хлора (Х) в процентах вычисляют по формуле:
V х 0,0035453 х А х 100
Х = -----------------------,
m Б
где:
V - объем 0,1 н раствора серноватистокислого натрия, израсходованный на титрование анализируемой пробы, куб. см;
0,0035453 - масса активного хлора, соответствующая 1 куб. см 0,1 н раствора серноватистокислого натрия, г;
А - исходный объем приготовленного раствора, куб. см;
m - масса навески препарата, г;
Б - масса раствора, взятого для титрования, куб. см.
За результат анализа принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 0,3%.
7. Приготовление нейтрализующих растворов
Нейтрализующие растворы готовят в концентрации в 10 раз меньше, чем концентрация использованного дезинфицирующего средства.
Раствор делают на стерильной воде в стерильной посуде и разливают в пробирки или флаконы с соблюдением правил стерильности (растворы уксусной кислоты и бикарбоната натрия можно стерилизовать автоклавированием). Раствор аммиака стерилизации не подлежит. Готовые пробирки (флаконы) можно хранить в течение пяти дней при комнатной температуре.
8. Приготовление тампонов
Ватные или марлевые тампоны для взятия смывов монтируют на алюминиевой проволоке, пропущенной через резиновую пробку. В пробирки разливают по 10 мл физиологического раствора, закрывают резиновыми пробками с вмонтированными тампонами и автоклавируют при 1 атм. в течение 30 мин.
9. Подготовка материалов для исследования методом отпечатков
9.1. Подготовка предметных стекол.
Для исследования используют предметные стекла (размером 2,5 х 7,5 см) или стекла, разрезанные вдоль на две половинки (1,2 х 7,5 см). Стекла предварительно кипятят 10 - 15 мин. в 2 - 5%-ном растворе моющего порошка ("Лотос", "Новость" и т.п.). Затем поверхность предметных стекол с двух сторон натирают с помощью зубной щетки или ерша этим же порошком, слегка увлажненным водой, после чего тщательно промывают в проточной воде, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Подготовленные стекла хранят в банке с притертой крышкой в сухом виде.
9.2. Обработка ванн и пробирок, предназначенных для транспортировки, хранения и инкубирования проб-отпечатков.
При взятии проб на широкие стекла используют пластмассовые ванны для окраски мазков крови на предметном стекле (ТУ 64-1), на узкие - бактериологические пробирки, закрытые резиновыми пробками.
Пластмассовые ванны разбирают и тщательно моют горячим мыльным раствором, после чего ополаскивают вначале водопроводной водой, затем 70%-ным этиловым спиртом или кипящей дистиллированной водой и обрабатывают 2 ч ультрафиолетовыми лучами. На дно подготовленной ванны помешают стерильную фильтровальную бумагу, затем ванны собирают и закрывают крышками.
Бактериологические пробирки и резиновые пробки моют и стерилизуют общепринятым способом. Перед стерилизацией на дно пробирки помещают небольшой ватный тампон.
9.3. Подготовка предметных стекол со средой.
В стерильном боксе на предметные стекла наносят тонкий слой расплавленной питательной среды: для выделения группы бактерий кишечной палочки используют агар Эндо, стафилококков - 8,5%-ный солевой мясопептонный агар (рН 7,2 - 7,4). Количество нанесенной среды должно соответствовать 0,15 мл (четыре капли) для узкого предметного стекла и 0,33 мл (восемь капель) для широкого.
Перед нанесением на стекло среду, находящуюся в пробирках, ставят в водяную баню и расплавляют. Затем в нее погружают стерильную пастеровскую пипетку. Температуру воды в бане поддерживают в пределах 80 - 90 °С.
Прогретые над пламенем горелки предметные стекла (берут корнцангом) раскладывают на ровной, строго горизонтальной поверхности стола. На них пипеткой наносят указанное количество питательной среды, отступив на 2 - 2,5 см от поперечного края стекла. Затем, расположив горизонтально пастеровскую пипетку, питательную среду быстро распределяют по средней трети поверхности стекла и подсушивают при комнатной температуре до появления вокруг питательной среды высушенной полосы шириной 0,5 - 1 мм. Широкие стекла со средой помещают в пластмассовые ванны, узкие - в пробирки.
Ванны и пробирки предварительно увлажняют путем внесения на дно 1 мл, 0,1 мл стерильной водопроводной воды соответственно.
Для удобства транспортировки ванны устанавливают в бюксы, пробирки - в металлические пеналы или в специально приспособленную сумку.
Подготовленные предметные стекла с солевым агаром хранят при температуре 4 °С до десяти суток, со средой Эндо - двое-трое суток (если нет видимого изменения цвета среды).
10. Подготовка стекол для микрокультивирования микобактерий
Предметные стекла разрезают вдоль на узкие полоски размером 1,2 х 7,5 см, моют и помещают на 2 ч в хромпик (40 г двухромовокислого калия высыпают в фарфоровую кружку или эксикатор и растворяют в небольшом количестве воды, затем осторожно добавляют концентрированную серную кислоту до общего объема 1 л).
После хромпика стекла вновь моют дистиллированной водой, протирают чистой льняной тканью, стерилизуют сухим жаром (160 °С) 2 ч и хранят в закрытых сосудах (эксикаторах).
11. Приготовление питательных сред
11.1. Среды для выделения кишечной палочки.
11.1.1. Модифицированная среда Хейфеца.
К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 4 г лактозы. Смесь доводят до кипения, затем фильтруют и после остывания определяют рН, который должен быть 7,4 - 7,8. Затем к среде добавляют в качестве индикатора 1 мл 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты и 2,3 мл 0,1%-ного водного раствора метиленовой сини. Среду разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 15 мин. Исходный цвет среды - красновато-сиреневый.
11.1.2. Питательная среда КОДА сухая.
Состав и способ приготовления приведены в этикетке на упаковке среды.
11.2. Среды для выделения стафилококка.
11.2.1. Солевой мясопептонный бульон. К обычному МПБ с рН 7,2 - 7,4 добавляют 6,5% натрия хлорида х.ч. или ч.д.а., перемешивают до полного растворения соли, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 1 атм. 20 - 30 мин.
11.2.2. Солевой мясопептонный агар.
К расплавленному МПА добавляют 8,5% натрия хлорида х.ч. или ч.д.а., перемешивают до полного растворения соли, разливают в колбы и стерилизуют при 1 атм. 20 - 30 мин. Перед использованием солевой агар разливают в стерильные бактериологические чашки по 10 - 15 см. После застывания среду подсушивают в термостате 1 ч.
11.3. Дифференциально-диагностическая среда для индикации Bac. anthracis.
11.3.1. Приготовление растворов ингредиентов.
Полимиксина М сульфат во флаконе растворяют в стерильной дистиллированной воде, а затем последовательными разведениями стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида доводят до концентрации 10000 ЕД/мл.
Невиграмон переносят в стеклянный флакон или пробирку и растворяют в 25%-ном водном растворе аммиака при тщательном перемешивании стеклянной палочкой. Затем последовательно разводят стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до концентрации 100 мкг/мл.
Моющее средство "Прогресс" растворяют стерильной дистиллированной водой до 0,1%-ной концентрации.
Гризеофульвин (в таблетках) тщательно растирают в ступке, затем растворяют в стерильной дистиллированной воде до содержания 100 мкг препарата в 1 мл.
Фенолфталеинфосфат натрия (заводской 10%-ный раствор) стерилизуют 30 мин. на водяной бане при 56 °С.
11.3.2. Приготовление дифференциально-диагностической среды.
100 мл питательного агара (в колбах) расплавляют в кипящей водяной бане и охлаждают до температуры 45 - 50 °С. Затем в агар добавляют 0,5 мл полимиксина М сульфата, столько же невиграмона, гризеофульвина <*>, такое же количество моющего средства "Прогресс" и 0,1 мл фенолфталеинфосфата натрия.
--------------------------------
<*> Гризеофульвин добавляют в среду при подозрении на загрязнение материала грибами.
После перемешивания среду разливают в чашки Петри (крышки открыты) и подсушивают 1,5 - 2 ч. Дифференциально-диагностическую среду после разлива можно хранить в холодильнике в течение одних-двух суток.
Готовую дифференциально-диагностическую среду выпускает Ставропольская научно-исследовательская ветеринарная станция (355100, г. Ставрополь, ул. Биологическая, 20).
11.4. Среда Сотона для выделения микобактерий.
В 940 мл дистиллированной воды растворяют 4 г аспарагина, 2 - лимонной кислоты, 0,5 - кали фосфорнокислого двузамещенного, 0,5 - сернокислой магнезии и 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа. Затем добавляют 60 мл нейтрального глицерина. После полного растворения аспарагина и солей рН среды должен быть 7,4. Среду разливают по 200 мл в колбы вместимостью 250 мл и стерилизуют 30 мин. в автоклаве при 1,5 атм.
Перед использованием в колбу со средой Сотона добавляют 30 мл стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота и разливают в стерильные пробирки по 7 - 8 мл.
12. Приготовление индикаторных пробирок для контроля качества дезинфекции аэрозолями формальдегида
Индикаторные пробирки - это стеклянные трубки диаметром 4 - 8 мм и длиной 40 - 50 мм. В качестве таких пробирок могут быть использованы пробирки Уленгута или отрезки пастеровских пипеток, запаянные с одного конца. Пробирки заливают расплавленной индикаторной средой до уровня обреза пробирок, запечатывают парафином и хранят 1 мес. (со дня изготовления) при температуре 0 - 5 °С.
Для учета результатов без линейки на индикаторные пробирки при их изготовлении можно нанести две риски на расстоянии 18 и 30 мм от среза пробирки.
Для экспресс-метода контроля качества аэрозольной дезинфекции помещений используют среду Эндо, выпускаемую биологической промышленностью в сухом виде; 2%-ную взвесь сухой среды в дистиллированной воде доводят до кипения и пропускают через ватный фильтр, после чего среду заливают в пробирки при помощи пипеток.
13. Подготовка тест-объектов для контроля качества дезинфекции спецодежды
В качестве тест-культур используют музейные штаммы кишечной палочки (E. coli - штамм 1257), золотистого стафилококка (St. aureus - штамм 209-F) и Bac. cereus - штамм 96.
Музейные культуры (после лиофильной сушки) хранят при температуре минус 4 °С не более двух лет, в виде посевов на МПА (посев уколом) под слоем стерильного вазелинового масла (толщина слоя 1,5 - 3 мм) не более шести месяцев.
Батистовую ткань стирают, гладят, нарезают на кусочки размером 5 х 10 мм, которые раскладывают по 50 шт. в чашки Петри. Чашки завертывают в плотную бумагу и стерилизуют 30 мин. в автоклаве при температуре 110 °С (0,5 атм.).
Стерильные тест-объекты в той же чашке Петри заливают смесью 2 млрд. взвеси тест-культуры и инактивированной сыворотки крови (или 40 - 50%-ной эмульсии кала животных), взятых в соотношении 1:1 (из расчета 1 мл на 1 тест-объект). Чашку Петри закрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Затем тест-объекты переносят в другую чашку Петри на поверхность стерильной фильтровальной бумаги, положенной в два слоя на дно чашки, покрывают сверху листом стерильной фильтровальной бумаги, чашку закрывают крышкой. Через 10 мин. тест-объекты переносят на поверхность листа стерильной фильтровальной бумаги в чашке Петри, подсушивают 20 - 30 мин. в термостате при 37 °С.
Приложение 4
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА АНОЛИТА
1. Качество анолита контролируют по концентрации активного хлора в анолите и величине рН.
2. Определение концентрации активного хлора в анолите проводят йодометрически по количеству гипосульфита, израсходованного на связывание свободного йода, вытесненного из йодистого калия активным хлором.
Для этого 10 мл раствора переносят в коническую или круглую плоскодонную колбу емкостью 100 мл. Добавляют пипеткой 10 мл 10%-ного раствора йодистого калия и 1,5 мл 25%-ной серной кислоты. Раствор ставят на 10 мин. в темное место, после чего оттитровывают 0,1 н раствором гипосульфита выделившийся йод с крахмалом в качестве индикатора.
Содержание активного хлора в процентах вычисляют по формуле:
0,00355 х А х 100 х К
Х = ---------------------,
10
где:
0,00355 - грамм-эквивалент хлора, соответствующий 1 мл 0,1 н раствора гипосульфита;
А - количество, мл, раствора гипосульфита, пошедшего на титрование;
100 - множитель для пересчета результатов в %, или 1000 - для пересчета содержания активного хлора в мг/л;
К - коэффициент поправки раствора гипосульфита (при приготовлении из фиксанала К = 1);
10 - объем анализируемого раствора, мл.
За результат анализа принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.
3. Определение величины рН анолита (и католита) проводят с использованием ионометра И-120.1 или ЭВ-74, или рН-150 в соответствии с инструкцией прибора.
|
