Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 мая 2013 года
Дата введения:
с момента утверждения
3.1.2. ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
ДИАГНОСТИКА КОКЛЮША И ПАРАКОКЛЮША
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
МР 3.1.2.0072-13
1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Федеральным бюджетным учреждением науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера"; Федеральным бюджетным учреждением науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Федеральным государственным бюджетным учреждением "Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства".
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 мая 2013 г.
3. Введены в действие с момента утверждения.
Термины и сокращения
АКДС - адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения
ГОСТ - Государственный стандарт
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА - иммуноферментный анализ
КУА - казеиново-угольный агар
МЕ - международные единицы
МУ - методические указания
ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция
ПСК - период судорожного кашля
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РА - реакция агглютинации
РИФ - реакция иммунофлуоресценции
РНК - рибонуклеиновая кислота
СанПиН - санитарно-эпидемиологические правила и нормы
СОЭ - скорость оседания эритроцитов
СП - санитарно-эпидемиологические правила
ТЕ - буфер Трис-ЭДТА
ТУ - технические условия
ФС - фармакопейная статья
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат
ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay (разновидность ИФА)
Ig - иммуноглобулин
IL - интерлейкин
FHA - filamentous haemagglutinin (филаментозный гемагглютинин)
NASBA - nucleic acid sequence-based amplification (метод амплификации РНК)
PT - pertussis toxin (коклюшный токсин)
RS-инфекция - инфекция, вызванная респираторно-синцитиальным вирусом
1. Область применения
В методических рекомендациях представлена современная микробиологическая характеристика коклюша в условиях массовой вакцинопрофилактики. В них содержится краткое описание рода Bordetella, включая новые виды, открытые в последнее десятилетие, более детальная характеристика биологических свойств B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica, описание бактериологического метода исследования с использованием приемов, повышающих его информативность, современных методов лабораторной диагностики: ПЦР и ИФА. Представлены алгоритмы диагностики коклюша в зависимости от вакцинального статуса, возраста и сроков заболевания пациентов. Цель настоящих методических рекомендаций - унифицировать подходы к лабораторной диагностике коклюшной инфекции.
Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Роспотребнадзора (микробиологов, эпидемиологов), специалистов по клинической лабораторной диагностике, инфекционистов, педиатров, семейных врачей и врачей общей практики.
2. Введение
В довакцинальную эру коклюш занимал второе место среди детских капельных инфекций по уровню заболеваемости и первое по уровню смертности. В настоящее время в мире ежегодно заболевает несколько миллионов человек, умирает около 200 тыс. (в 2008 г. - 16 млн. заболевших, 195 тыс. смертей).
Специфическая профилактика коклюша, проводимая в нашей стране с 1959 года, отчетливо повлияла на эпидемический процесс, биологические свойства возбудителя и клинику. Этапы массовой иммунизации характеризовались различным уровнем охвата детей прививками против коклюша и, в соответствии с этим, менялась эпидемиологическая обстановка. Низкий уровень иммунизации в 90-е годы привел к росту заболеваемости коклюшем. Достижение охвата прививками детей первого года жизни (более 95%) в последующие годы и поддержание его на этом уровне обеспечило не только снижение заболеваемости коклюшем, но и с 2001 г. стабилизацию показателей на минимальном уровне (3,2 - 5,7 на 100 тыс. населения). Особенностью эпидемического процесса коклюша на фоне высокого охвата прививками детей раннего возраста является возникновение периодических подъемов. Это объясняется недостаточной напряженностью и длительностью поствакцинального иммунитета, создаваемого в условиях нередкого нарушения календаря прививок, в частности несоблюдения сроков вакцинации и интервалов между введениями доз вакцины и проведением ревакцинации, что способствует накоплению значительного числа неиммунных лиц. Увеличение охвата прививками привело в настоящее время к изменению возрастной структуры лиц, заболевших коклюшем. Большинство заболевших составляют школьники 7 - 14 лет - до 50,0%, дети 3 - 6 лет - до 25,0%, наименьшую долю - дети в возрасте 1 - 2 лет - 11,0% и дети до 1 года - 14,0%. В периоды подъема заболеваемости коклюшем интенсивность эпидемического процесса определяется заболеваемостью детей школьного возраста. Темпы роста в этой группе увеличиваются в 2 - 3 раза. Из числа лиц, заболевших коклюшем, 65,0% составляют привитые.
Поствакцинальный иммунитет не предохраняет от заболевания. Коклюш в этих случаях протекает в виде легких и стертых форм инфекции, которые диагностируются, в основном, ретроспективно (серологически). После перенесенного заболевания остается более длительный иммунитет.
Истинная заболеваемость коклюшем значительно выше за счет недиагностированной коклюшной инфекции (легких и стертых клинических форм). Трудности клинической диагностики коклюша на ранних стадиях заболевания, отсутствие обследования всех длительно (свыше 7 дней) кашляющих или его проведение на поздних сроках заболевания, а также после продолжительного лечения антибактериальными препаратами приводит к низкому проценту выявляемости возбудителя инфекции. Уровень бактериологического подтверждения диагноза составляет 10 - 20%. Современные методы исследования позволяют проводить раннюю диагностику заболевания (ПЦР) и существенно облегчают постановку диагноза (ПЦР, ИФА).
Таким образом, коклюш в нашей стране требует пристального внимания со стороны врачей различных специальностей. Своевременная и качественная лабораторная диагностика коклюшной инфекции позволит избежать ошибок в постановке диагноза и будет способствовать эффективной терапии.
3. Характеристика рода Bordetella, биологические
свойства возбудителей коклюша и паракоклюша
Род Bordetella относится к семейству Alcaligenaceae и включает 9 видов: B. ansorpii, B. avium, B. bronchiseptica, B. hinzii, B. holmesii, B. parapertussis, B. pertussis, B. petrii, B. trematum. Первой (в 1908 г.) была описана B. pertussis, бактерия патогенна для человека и является возбудителем коклюша. B. parapertussis была описана в 1938 г., вызывает у людей паракоклюш (коклюшеподобное заболевание), она также была выделена от овец. B. bronchiseptica была описана в 1911 г., является возбудителем заболеваний дыхательных путей у многих млекопитающих (кашля у собак, атрофического ринита у свиней и др.), но встречается также бессимптомное носительство. У человека редко вызывает заболевание, однако описаны случаи, когда у пожилых людей, заразившихся от домашних животных (кроликов), B. bronchiseptica вызывала длительный кашель. B. avium описана в 1984 г., является возбудителем ринотрахеита у птиц. Описано несколько случаев выделения B. avium от пожилых пациентов с отягощенным анамнезом, с клинической картиной пневмонии. В 1995 г. были описаны сразу два новых вида: B. hinzii и B. holmesii. B. hinzii колонизирует дыхательные пути домашней птицы, была выделена от иммуноскомпрометированных пациентов, описан случай летальной септицемии. B. holmesii выделялась только от людей, обнаруживалась в мокроте, несколько раз в крови, этиологическая роль в развитии инфекций не доказана. В 1996 г. выделена B. trematum, возбудитель вызывает раневые и ушные инфекции. В 2001 г. была описана B. petrii, единственный представитель рода, выделенный из окружающей среды и способный жить в анаэробных условиях. В 2005 г. была выделена B. ansorpii, описано несколько случаев выделения от пациентов с онкологическими заболеваниями (из гнойного содержимого эпидермальной кисты, из крови).
Морфологические и культуральные свойства
Бактерии рода Bordetellae - мелкие (0,2 - 0,5 мкм x 0,5 - 2,0 мкм) грамотрицательные коккобациллы. В мазках - часто биполярно окрашенные, одиночные или в парах, реже в цепочках, имеют нежную капсулу. Все, за исключением B. petrii, - строгие аэробы. Температура выращивания бордетелл 35 - 37 °C (оптимально 35 °C). Бордетеллы требовательны к условиям роста: 130 - 150 мг% аминного азота, кровь, дрожжевой экстракт, никотиновая кислота, аминокислоты (цистин, пролин, метионин, серин, глютамин и др.); наиболее требователен возбудитель коклюша, он растет только на специальных средах, в то время как остальные представители рода растут на кровяном агаре. Классической средой для первичного выделения B. pertussis является среда Борде-Жангу (картофельно-глицериновый агар), позднее были предложены синтетические и полусинтетические среды, в частности казеиново-угольный агар (КУА). На указанных средах бордетеллы вырастают в виде характерных колоний: на среде Борде-Жангу - выпуклые, гладкие, блестящие, серебряного цвета, напоминающие капли ртути, окруженные зоной гемолиза; на КУА - выпуклые, гладкие, серого цвета, с жемчужным, желтоватым или беловатым оттенком. Колонии маслянистые, легко снимаются петлей. B. parapertussis и B. holmesii за счет образования пигмента вызывают потемнение сред с кровью, образуют бурую подложку.
Таблица 1
РОСТОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОСНОВНЫХ ВИДОВ БОРДЕТЕЛЛ
┌─────────────────────────┬────────────┬────────────────┬─────────────────┐
│ │B. pertussis│B. parapertussis│B. bronchiseptica│
├─────────────────────────┼────────────┼────────────────┼─────────────────┤
│Время, необходимое для │ │ │ │
│появления колоний (сут.):│ │ │ │
│- на КУА (бордетелагар) │2 - 3 │1 - 2 │18 - 24 ч │
│- на среде Борде-Жангу │3 - 6 │2 - 3 │1 - 2 │
├─────────────────────────┼────────────┼────────────────┼─────────────────┤
│Размер колоний на КУА │1 - 2 мм │2 - 3 мм │4 мм │
├─────────────────────────┼────────────┼────────────────┼─────────────────┤
│Рост на простом агаре │- │+ │+ │
└─────────────────────────┴────────────┴────────────────┴─────────────────┘
Устойчивость: возбудители коклюша и паракоклюша - облигатные паразиты, нестойкие. Погибают при прогревании до 50 °C за 30 мин. при обработке дезинфицирующими растворами. Во внешней среде не сохраняются. Устойчивы ко многим антибиотикам.
Биохимические свойства
Основные биохимические свойства бордетелл, которые используются в практической работе при изучении выделенных культур, представлены в табл. 2.
Таблица 2
ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЕ ПРИЗНАКИ ВИДОВ РОДА BORDETELLA
|
Рост на
кровяном
агаре
|
Окси-
даза
|
Уреаза
|
Тиро-
зиназа
|
Восста-
новление
нитратов
|
Утили-
зация
цитратов
|
Подвиж-
ность
|
B. pertussis
|
-
|
+
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
B. parapertussis
|
+
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
B. bronchiseptica
|
+
|
+
|
+ <*>
|
-
|
+
|
+
|
+
|
B. avium
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
B. hinzii
|
+
|
+
|
+/-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
B. holmesii
|
+
|
-
|
-
|
+
|
-
|
-
|
-
|
B. trematum
|
+
|
-
|
-
|
-
|
+/-
|
-
|
+
|
B. petrii
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
+
|
-
|
B. ansorpii
|
+
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
<*> Через 4 часа.
|
B. pertussis наименее активна ферментативно (положительный тест на оксидазу). B. parapertussis вырабатывает ферменты тирозиназу и уреазу и не образует оксидазы. Тирозиназа катализирует продукцию пигментов из тирозина, содержащегося в питательных средах, что вызывает их потемнение. Наиболее активна B. bronchiseptica: вырабатывает уреазу, оксидазу, утилизирует цитраты, восстанавливает нитраты до нитритов.
Антигенное строение и серологическая характеристика
К факторам патогенности B. pertussis в первую очередь относят коклюшный токсин. Это экзотоксин, белок с молекулярной массой 117000 Да, состоящий из двух функциональных частей (A и B) и пяти структурных субъединиц (S1 - S5): фрагмент A (соответствует субъединице S1) - обладает ферментативной активностью, ингибирует клеточную аденилатциклазу. Участок B (состоит из субъединиц S2 - S5) отвечает за присоединение токсина к рецепторам клеток-мишеней. Токсин обладает высокой иммуногенностью, в инактивированной форме включен в состав всех бесклеточных коклюшных вакцин. Определение антител к коклюшному токсину методом ИФА применяется для диагностики коклюша и контроля эффективности вакцинации.
|
