Протеомный профиль мочи здорового человека в норме и при действии факторов космического полета
|
Скачать 5.39 Mb.
|
Процессы, которые участвуют в создании белковой композиции крови.
По своему происхождению белки плазмы крови разделяют на: белки, секретируемые тканями и функционирующие в плазме с молекулярным весом (МВ) >45 kDa; антитела, как уникальный класс функционирующих в плазме белков (более 10 млн. разновидностей); дистанционные рецепторные лиганды (классические пептиды и гормоны), имеющие различный МВ и появляющиеся в различные периоды времени для реализации своих функций; локальные рецепторные лиганды (цитокины и другие медиаторы клеточного ответа); временно присутствующие в плазме негормональные белки, «адресованные» определенным структурам (например, лизосомальные белки); белки-продукты повреждения тканей, появляющиеся вследствие гибели или повреждения клеток (например, сердечные тропонины, миоглобин, креатин-киназы); аберрантные белки, высвобождающиеся из опухолевых тканей; инородные белки бактерий или паразитов. В печени, как наиболее важном органе в белковом обмене, образуется 15-50 г белка в сутки и происходят следующие процессы: дезаминирование аминокислот (дезаминирование осуществляется и в других тканях организма, особенно в почках, но по значимости эти процессы несопоставимы с дезаминированием аминокислот в печени); образование мочевины и извлечение аммиака из жидких сред организма; взаимное превращение различных аминокислот и синтез из аминокислот других соединений; образование белков плазмы крови [Kmieć Z., 2001]. В плазму крови из печени секретируются фибриноген и альбумины крови, большая часть α- и β-глобулинов и липопротеиды [Nakano M., Kubota M., Owada S., Nagai R., 2013]. В кровь из ретикулоэндотелиальной системы костного мозга и лимфатических узлов секретируются β-глобулины и γ-глобулины [Laudisi F. et al., 2013], пептидные гормоны в основном секретируют клетки эндокринных желез [Arakelyan K.P. et al., 2007], однако эритропоэтин - клетки почки [Wang P. et al., 2013]. В плазме крови, при суммарной концентрации белка 60-80 г/л, содержится 7% общего количества белков организма [Северин Е.С., 2013], примерно 90% составляют альбумины, иммуноглобулины, липопротеины, фибриноген, трансферрин. По молекулярному весу белки плазмы крови различаются в широких пределах – их МВ колеблется от 44 000 до 1 300 000. Белки плазмы крови выполняют множество функций: поддерживают коллоидно-осмотическое (онкотическое) давление и, тем самым, постоянный объем крови [Craft E.M., Powell L.L., 2012]; ряд белков, в том числе фибриноген, являются основными компонентами системы гемостаза [Anderson E.L. et al., 2013]; определяют вязкость крови и играют важную роль в поддержании гемодинамики в сердечно-сосудистой системе [Kwaan H.C., 2010]. Белки также принимают участие в поддержании постоянства рН крови, так как составляют одну из ее важнейших буферных систем [Leclercq L., Modena E., Vert M., 2013]. Они выполняют транспортную функцию [Sitar M.E., Aydin S., Cakatay U., 2013]; участвуют в процессах иммунитета [Hyvärinen S. et al., 2014]. С белками плазмы связано 40–50% кальция, значительная часть железа, магния, меди и других элементов; кроме того, протеины являются резервом аминокислот. Белковая композиция крови динамически подвижна, отражая изменения в функционировании систем и органов организма, что используется в клинической диагностике и терапевтическом мониторинге заболеваний [Anderson N.L., Anderson N.G., 2002]. Ни один из компонентов белковой композиции крови не является гомеостатической константой, уровень ни одного из белков крови (исключая гормоны пептидной природы) не подвержен жесткому контролю и регуляции, за исключением уровня альбумина, который наряду с другими небелковыми компонентами, является составляющей строгой гомеостатической константы – осмоляльности крови. Белки плазмы крови, печени и мышц могут служить в качестве «резервных», хотя эти резервы по своему существу отличаются от резервов углеводов (отложение гликогена в печени и мышцах) и липидов (отложение триацилглицеролов в жировых депо). Существование в организме механизма срочной мобилизации белковых ресурсов в экстремальных условиях (голодание, тяжелая интоксикация, потеря крови и другие), несомненно, и оно имеет важное физиологическое значение. Помимо «основных» белков, в крови содержится большинство белков человеческого организма - тканевые белки попадают в кровь в результате секреции, «подтекания» или разрушения клеток.
Во всех многоклеточных организмах поддерживается баланс между пролиферацией и гибелью клеток. Существуют две формы клеточной гибели — некроз и апоптоз. И если некроз является пассивным процессом массированного разрушения клеток в ответ на повреждающее действие какого-либо агента, то апоптоз - это активный, физиологический процесс, строго контролируемый организмом, являющийся обязательным компонентом жизнедеятельности многоклеточных организмов [Прохоренков В.И., Рукша Т.Г., Петрова Л.Л., Салмина А.Б., 2005]. Апоптоз может регулироваться как внешними факторами, так и автономными механизмами. Формирование механизма апоптотической гибели клеток является одним из самых ранних и фундаментальных достижений эволюции, результатом которой стало возможным появление всё более сложных многоклеточных организмов. Апоптоз, как генетически запрограммированное самоубийство клетки, играет ключевую роль в ряде процессов развития организма, его нормальной жизнедеятельности и регенерации тканей, поскольку позволяет организму использовать высвобождающиеся ресурсы в виде сложно организованных молекул и их комплексов. Для клетки, подвергающейся апоптозу, характерны такие морфологические изменения, как: конденсация хроматина, фрагментация и разрушение ядра; сжатие цитоскелета; набухание клеточной мембраны. В дальнейшем клетки фрагментируются, образуются «апоптозные тела». При этом возрастает внутриклеточная концентрация Са2+; активируются протеазы-каспазы; ДНК режется на фрагменты; клеточная поверхность меняется - теряется сиаловая кислота, связанная с гликопротеинами и гликолипидами, что вызывает быстрый фагоцитоз клетки макрофагами или соседними клетками [Северин Е.С., 2013]. Все цитозольные белки гибнущей клетки попадают во внеклеточную жидкость, пополняя собой, в том числе, и плазменный пул белков. Поэтому в протеоме крови обнаруживаются белки «внутреннего хозяйства» клеток, имеющие внутриклеточную функцию в качестве своего главного назначения.
Протеомика на основе масс-спектрометрии покончила с представлениями о том, что моча - безбелковая жидкость. Белки попадают в первичную мочу из крови. Считают, что протеомы мочи и крови на 70% состоят из одних и тех же протеинов [Nagaraj N., Mann M., 2011], но кроме белков крови в моче выявляются белки почечного происхождения. На начальном этапе мочеобразования, низкомолекулярные компоненты плазмы крови, такие как электролиты, продукты обмена (креатинин), β2-микроглобулин, α1-микроглобулин и ретинол-связывающий белок (RBP) – фильтруются в клубочках нефрона [Vinge L. et al., 2010]. Фильтрация происходит через гломерулярный барьер, где из жидкой части крови образуется до 180 литров первичной мочи [Adachi J. et al., 2006; Eaton D.C., 2012]. Первичная моча, из-за селективности мембраны, содержит белки с низким молекулярным весом (<60 кДа), такие, как транспортные белки - витамин Д-связывающий белок, RBP. Белки группы альбумина частично фильтруются: коэффициент фильтрации альбумина составляет 0,00062, концентрация альбумина в ультрафильтрате колеблется от 1 до 50 мкг/мл [Amsellem S. et al., 2010]. Однако прохождение гломерулярного фильтра альбумином, имеющего при физиологических значениях рН отрицательный заряд и радиус молекулы 3,6 нм, затруднено главным образом из-за отрицательного заряда молекулы, а не из-за её размера. В норме, альбумин составляет около 25% от всех белков, экскретируемых почками. Это соотношение может меняться, в частности, в случае протеинурии. После прохождения через фильтр, такие высоко представленные белки сыворотки (находящиеся в сыворотке и плазме крови в высокой концентрации), как легкая цепь иммуноглобулина, трансферрин, витамин Д-связывающий белок, миоглобин и до 94% профильтровавшегося альбумина реабсорбируются, главным образом, в проксимальных почечных канальцах [Vinge L. et al., 2010]. В проксимальных сегментах нефрона происходит реабсорбция около 66% от всего объема гломерулярного фильтрата. Механизм реабсорбции в нефроне позволяет предотвратить потери белков орагнизмом. Существует теснейшая структурно-функциональная связь между реабсорбцией натрия, воды, хлоридов, фосфатов, бикарбоната и изменениях в различных звеньях процесса реабсорбции белка [Poupin N. et al., 2012]. За реабсорбцию белков из первичной мочи в проксимальных канальцах нефрона (ПК) ответственен рецептор-опосредованный эндоцитоз. Скорость эндоцитоза увеличивается пропорционально концентрации белка в клубочковом фильтрате до тех пор, пока не достигается максимальная скорость образования эндоцитозных пузырьков. Далее, в процессе реабсрбции образовавшиеся эндоцитозные вакуоли движутся в сторону базальной части клетки и сливаются с лизосомами. В эндолизосомальных пузырьках осуществляется протеолиз белков [Doherty G.J., Mc Mahon H.T., 2009]. При этом в кровь возвращается практически вся глюкоза, аминокислоты, витамины, значительное количество ионов [Haraldsson B., 2010]. Иной механизм обеспечивает реабсорбцию небольших линейных пептидов (таких, как ангиотензин II, брадикинин). Эти пептиды гидролизуются ферментами щёточной каёмки эпителия проксимального канальца, после чего аминокислоты транспортируются в клетку [Carone F.A., Peterson D.R., 1980]. У практически здорового человека, в обычных условиях жизнедеятельности, содержание белка в суточной моче не превышает 150 мг (что составляет уровень физиологической протеинурии). Экскреция белка в концентрации более 150 мг/день считается в клинике протеинурией и является показателем нарушением работы гломерулярного фильтра или процессов реабсорбции [Наточин Ю.В., 1993; Adachi J. et al., 2006].
до развития протеомики на основе масспектрометрииФункциональное состояние гломерулярного барьера, канальцевого аппарата, особенности гемодинамики, концентрация и качественный состав белков плазмы, а также активность системы регуляции их транспорта в ПК определяют концентрацию белка в моче, его качественные характеристики. Нормальная концентрация белка в моче составляет до 150 мг/л, что примерно в 1000 раз меньше, чем в плазме [Наточин Ю.В., 1993]. Это свидетельствует о высокой эффективности гломерулярного фильтра, препятствующего потере белка из русла крови [Шейман Д.А., 2007]. Общий анализ белка в моче является одним из наиболее массовых клинико-диагностических исследований [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005]. Отмечают, что поскольку в моче присутствуют множество соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций метода определения, а содержание белка в моче здорового человека достаточно низкое, сопоставимое с чувствительностью методов исследования, значения уровня белка в моче широко варьируют [Ларичева Е.С. с соавт. 2009]. Анализ мочи остается одной из тех лабораторных процедур, которые сложнее всего поддаются стандартизации, в виду возможных нарушений протоколов сбора, обработки и хранения образцов мочи [Козлов А.В., Ларичева Е.С., 2012]. Все методы определения белка в моче можно разделить на качественные, полуколичественные, количественные. Как показывают многочисленные исследования, ни один из большого числа известных методов качественного определения белка в моче не позволяет получать надежные и воспроизводимые результаты. О содержании белка в моче судят по интенсивности сине-зеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с мочой. Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи. В последнее время приобрели популярность методы сухой химии, благодаря своей простоте, скорости выполнения анализа. Тем не менее, одним из недостатков этих методов, приводящих к искажению диагностической информации, является большая чувствительность индикатора бромфенолового синего к альбумину по сравнению с другими белками. Определение белка с помощью диагностических полосок не является надежным индикатором низких уровней протеинурии (большинство выпускаемых в настоящее время диагностических полосок не обладают способностью детектировать белок в моче в концентрации ниже, чем 0,15 г/л). Отрицательные результаты определения белка на полосках не исключают присутствия в моче глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса. Ложноположительные результаты могут быть связаны с высокой концентрацией мочевины. Для количественного определения белка в моче в клинических лабораториях используют в основном два типа методов: турбидиметрические и колориметрические. Турбидиметрические методы основаны на преципитации белка различными химическими агентами: сульфосалициловой кислотой, трихлоруксусной кислотой, бензетоний хлоридом [Ким Ю.В., Шибанов А.Н., 2005]. Турбидиметрические методы плохо поддаются стандартизации [Dilena B.A., Penberthy L.A., Fraser C.G., 1983], что приводит к получению ложных результатов, однако, в настоящее время эти методы широко используются в лабораториях из-за невысокой стоимости и доступности реактивов [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2007]. К группе колориметрических методов определения белка относятся методы Лоури, биуретовый и методы, основанные на связывании белка с органическими красителями. Метод Лоури обладает высокой чувствительностью: ~10 мг/л и широкой линейной областью измерения – до 1 г/л. Однако результаты анализа значительно зависят от аминокислотного состава белка – интенсивность окрашивания различных белков может различаться в 300 и более раз [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005]. Некоторые лекарственные препараты – салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны оказывать влияние на результаты исследования, полученные данным методом. Биуретовый метод практически не зависит от аминокислотного состава белков, это реакция на пептидные связи белка: для протекания реакции достаточно наличие двух пептидных связей в молекуле исследуемого вещества, т. е. в реакцию могут вступать низкомолекулярные белки и пептиды, начиная с трипептидов. Этот метод высокоспецифичен, поскольку в реакции не участвуют присутствующие в пробе соединения небелковой природы [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005; Marshall T., Williams K.M., 2000]. Область линейной зависимости оптической плотности от содержания белка примерно в 10 раз шире, чем у метода Лоури, однако чувствительность – примерно в 10 раз ниже, что непригодно для определения минимальных количеств белка в моче здорового человека. В связи с этим, она чаще всего используется для количественного определения белка после его осаждения [Ларичева Е.С. с соавт. 2009]. Методы, основанные на связывании белка с органическими красителями, привлекают к себе внимание благодаря простоте, быстроте исполнения и высокой чувствительности [Dilena B.A., Penberthy L.A., Fraser C.G., 1983; Ramakers J.M., 1984]. Однако они также имеют некоторые недостатки, одним из которых является различие в способности белков связывать те или иные красители [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005], другим - нарушение линейной зависимости между концентрацией некоторых белков и оптической плотностью комплекса белок-краситель [Шишкин С.С., 1982; Загребельный С.H., Пупкова В.И., 1983]. Наиболее широко используемыми красителями в лабораторной практике определения белка являются кумасси бриллиантовый голубой, бромфеноловый синий и пирогаллоловый красный. Так, краситель кумасси бриллиантовый синий способен связываться с положительно заряженными аминогруппами аминокислот, входящими в состав белковой молекулы, с образованием комплекса с максимумом поглощения при 595 нм. При этом комплекс белок-краситель обладает интенсивным поглощением, что обеспечивает высокую чувствительность методу и требует для исследования небольшого объема образца [Ларичева Е.С. с соавт., 2009; Ramakers J.M., 1984]. Различные белки обладают неодинаковой способностью связывать данный краситель, так, если поглощение комплекса кумасси бриллиантовый синий - альбумин принять за 100%, то для гемоглобина и трансферрина оно оказывается таким же, однако оптическая плотность комплекса с глобулинами, а также свободными κ- и λ-цепями иммуноглобулинов составляет всего лишь около 60% [Ramakers J.M., 1984]. Частично эти недостатки устраняются с помощью некоторых модификаций метода [Marshall T., Williams K.M., 2000]. Краситель бромфеноловый синий связывается преимущественно с альбумином, а не глобулинами и другими белками, поэтому определение белка в моче, содержащей сложную смесь белков, данным методом не обеспечивает необходимую точность анализа [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005; Ларичева с соавт., 2009]. Fujita с соавт., в 1983 году предложили использовать для определения белка в моче органический краситель – пирогаллоловый красный [Fujita Y., Mori I., Kitano S., 1983]. Широкое применение в лабораторной практике данный метод получил после его модификации Watanabe с соавт. [Watanabe N. et al., 1986]. Методика основана на связывании белка с красителем в кислой среде (рН ~2,5); на результаты определения не влияет присутствие в моче многих соединений, в том числе, лекарственных препаратов и их метаболитов, солей, оснований, кислот. Предложенная модификация позволила расширить линейную область измерения до 2 г/л, при этом надежность и воспроизводимость модифицированного метода соответствуют клиническим требованиям. «Тест на открытие» в этом методе при определении альбумина дает показатели 97–102%, глобулина – 69–72%; чувствительность метода составляет 30–40 мг/л. Вещества, присутствующие в моче, дают суммарную ошибку определения менее 2%. Данный метод является лучшим среди других колориметрических методов, он прост и удобен для ручного исполнения в клинических лабораториях и адаптации на автоматических анализаторах [Ларичева Е.С. с соавт., 2009; Marshall T., Williams K.M., 2004]. Результаты количественного определения содержания белка во фракционной моче зависят от ее объема и степени разведения, могут не совпадать с таковыми при исследовании суточной мочи. Полагают, что нормализация результата определения уровня белка на показатель осмолярности мочи (отношение белок/осмолярность), либо пересчет на содержание креатинина (отношение белок/креатинин), позволяет приблизить результаты определения белка в случайной пробе мочи к результатам определения белка в суточном диурезе [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005]. Следует отметить, что все вышеперечисленные стандартные лабораторные методы используются для определения суммарного уровня белка в моче, без возможности исследовать белковую композицию образца. Долгое время единственным методом анализа сложных белковых смесей, таких как плазма крови, оставался электрофорез. Использование высокоразрешающего метода двумерного электрофореза (2-DE) позволило впервые составить карту белков плазмы крови [Anderson L., Anderson N.G., 1977], на которой детектировали примерно 300 пятен, из которых исследователи смогли идентифицировать 40 белков. Более полная протеомная карта плазмы крови была получена в 1991 году, на которой было выделено 727 пятен, 376 из которых были идентифицированы как 49 различных белков [Anderson N.L., Anderson N.G., 1991]. Хотя метод 2-DE является одним из самых известных и распространенных методов анализа биологических жидкостей и имеет ряд преимуществ перед другими технологическими платформами, опубликовано не так много работ по его применению в исследовательских целях, такие как поиск биомаркеров заболеваний в плазме (сыворотке) крови [Трифонова О.П., 2011]. По мнению Воронцова с соавт., наиболее точным и чувствительным методом, позволяющим обнаружить скрытые изменения функции различных участков нефрона, является метод уропротеинограммы [Воронцов А.Л., Нестеровская А.Ю., Потапова Л.А., 2005]. Основанный на электрофоретическом определении спектра нативных белков мочи, он дает возможность выявить характер и выраженность изменений функционального состояния нефрона, позволяет отследить динамику процесса, выявить причины микропротенурий, зафиксировать преморбидные состояния и скрытую патологию почек на стадиях, не манифестируемых при стандартном клиническом обследовании [Воронцов А.Л., Нестеровская А.Ю., Потапова Л.А., 2005].
|
Похожие:
 |
И зучение мутационных сдвигов у терапевтических бактериофагов после... Изучение мутационных сдвигов у терапевтических бактериофагов после пребывания в условиях космического полета (фаген) |
|
Исследование мочи имеет большое диагностическое значение не только... Стандартизованная технология клинического лабораторного анализа мочи. Анализ мочи общий |
 |
Академик Виктор Иванович Кузнецов. К 100-летию со дня рождения Моделирование в трансзвуковой трубе низкой (переменной) плотности условий полёта космического аппарата при его посадке на поверхность... |
|
Академик Виктор Иванович Кузнецов. К 100-летию со дня рождения Моделирование в трансзвуковой трубе низкой (переменной) плотности условий полёта космического аппарата при его посадке на поверхность... |
|
2010 содержание ... |
|
Конспект для самоподготовки слушателей по курсу повышения квалификации «Охрана труда» Один из основных факторов, влияющих на работоспособноть и здоровье человека. Метеорологические факторы, сильно влияют на жизнедеятельность,... |
|
«Корпоративные практики по поддержке здорового образа жизни и устранению... России непоколебимо являются сохранение и укрепление здоровья населения на основе популяризации здорового образа жизни и обеспечения... |
|
Исследование мочи 4 Процесс образования мочи 4 Физические свойства... России. За это время существенно расширена номенклатура диагностических тест-полосок, существенно расширена область использования... |
|
Сравнительная характеристика натуральных киллерных клеток человека в норме и при раке легкого Работа выполнена в Республиканском государственном предприятии «Институт молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина» Комитета... |
|
При эксплуатации персональных компьютеров Инструкция предназначена для предотвращения неблагоприятного воздействия на человека вредных факторов, сопровождающих работы со средствами... |
|
В россии отмечают День космонавтики в ознаменование первого космического... Юрием Алексеевичем Гагариным. Праздник установлен указом Президиума Верховного Совета СССР от 9 апреля 1962 года. В этот день в 1961... |
|
Задача экскурсовода рассказать о влиянии никотина на изображенные органы человека Цель: профилактика подросткового табакокурения, пропаганда здорового образа жизни |
|
Меморандум №2 Комиссия по борьбе с лженаукой и фальсификацией научных... Ьбе с лженаукой и фальсификацией научных исследований при Президиуме ран (далее в тексте — Комиссия) посвящен гомеопатии. Гомеопатия... |
|
Руководство образовательной организации Гаоу дпо "Институт развития образования", "Формирование здорового образа жизни, здорового питания" (24 часа), 24-26. 10. 2016 г |
|
Инструкция по поиску и спасанию в зоне авиационно-космического поиска... Организация поисково-спасательного обеспечения полетов в Южной зоне авиационно-космического поиска и спасания (акпс) |
|
Методические рекомендации по общей гигиене для самостоятельной работы... Производственная среда как часть окружающей человека внешней среды складывается из природно-климатических факторов и факторов, связанных... |