Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам

0. 
   Настоящие методические указания устанавливают стандартные методы
   определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам
   (методы серийных разведений и диско-диффузионный метод).
   
   
   
1. 
   Методические указания предназначены для применения в микробиологических лабораториях лечебно-профилактических учреждений, Центров госсанэпиднадзора
   и научно-исследовательских учреждений на территории Российской Федерации.
   

Определение чувствительности микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам (АБП) приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибиотикорезистентности у бактерий. Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП (диско-диффузионный и серийных разведений) были разработаны во второй половине 60-х – начале 70-х годов ХХ века [1, 2], и с тех пор с методической точки зрения не претерпели принципиальных изменений.

Однако внедрение в клиническую практику значительного количества новых АБП и появление новых механизмов антибиотикорезистентности у микроорганизмов потребовало более строгой стандартизации процедуры тестирования, разработки новых подходов к интерпретации результатов, внедрения современной системы внутреннего контроля качества на каждом этапе исследования.

Указанные тенденции находят свое отражение в национальных рекомендациях по определению чувствительности микроорганизмов к АБП, которые разрабатываются и регулярно обновляются профессиональными сообществами микробиологов разных стран мира.

Наиболее известными национальными рекомендациями являются документы, разработанные:

В рамках общего процесса интеграции стран Европейского Союза разработкой единых Европейских рекомендаций по определению чувствительности различных видов микроорганизмов к АБП занимается специальный Европейский комитет по определению чувствительности к антибиотикам (European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing – EUCAST), созданный Европейским обществом по клинической микробиологии и инфекционным болезням (European Society for Clinical Microbiology and Infectious Diseases – ESCMID). В настоящее время опубликованы рекомендации по определению чувствительности методом серийных разведений [9].

В настоящих Методических указаниях предпринята попытка систематического изложения современных подходов к определению чувствительности бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний человека с учетом перечисленных выше рекомендаций.

Исследования чувствительности микроорганизмов к АБП осуществляются для решения следующих задач:

В ходе повседневной деятельности в бактериологических лабораториях лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) и Центров госсанэпиднадзора (ЦГСН) из различных биологических материалов и объектов внешней среды выделяют множество бактерий, относящихся к различным таксономическим группам. Однако определение чувствительности выделенных микроорганизмов к АБП показано далеко не во всех случаях. Определение показаний для исследования чувствительности микроорганизмов
к АБП является обязанностью врача-бактериолога.

Определять чувствительность к АБП представителей нормальной микрофлоры человека, при их выделении из естественных мест обитания, бактерий выделенных из объектов внешней среды, за исключением случаев проведения специальных исследований, нецелесообразно.

Обязательному исследованию на чувствительность к АБП подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека. В остальных случаях оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма.

Определение чувствительности выделенного штамма микроорганизма показано, если уровень его устойчивости к АБП не может быть предсказан на основании данных идентификации или вероятной таксономической принадлежности микроорганизма. Практически важной задачей является выявление приобретенной резистентности к АБП у природно-чувствительных к ним микроорганизмов. Подтверждение природной чувствительности или резистентности микроорганизма к АБП не является целью практических исследований.

Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева образца клинического материала, в последнем случае параллельно необходимо провести идентификацию культуры.

При обнаружении на плотных питательных средах после первичного посева смешанной культуры исследовать антибиотикочувствительность до идентификации и оценки этиологической значимости отдельных микроорганизмов нецелесообразно.

Прямое определение чувствительности с использованием клинического материала (без выделения чистой культуры) возможно только в исключительных случаях при условии подтверждения однородности культуры и высокой степени обсемененности при окраске по Граму, причем исследование следует повторить после выделения чистой культуры микроорганизма.

Следует уделять особое внимание определению чувствительности микроорганизмов, относящихся к таксономическим группам, для которых характерна высокая частота распространения приобретенной резистентности.

У микроорганизмов, проявляющих универсальную чувствительность к каким-либо АБП, т.е. когда случаев резистентности не описано (например, Streptococcus pyogenes - все штаммы чувствительны к пенициллину), проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседневной практике нецелесообразно.

Факты выявления резистентности у микроорганизмов, для которых этот феномен ранее не был описан в научной литературе, следует оценивать с крайней осторожностью, а полученные штаммы рекомендуется отправлять в референтные лаборатории и в специализированные учреждения для проверки.

Не следует в практических целях исследовать микроорганизмы, для которых методы определения чувствительности в настоящее время не стандартизованы и отсутствуют критерии интерпретации результатов. Результаты, полученные в данном случае, не могут служить основанием для назначения антибактериального препарата, если соответствующая нозологическая форма не приведена в утвержденной инструкции по его применению.

Основные этапы проведения тестирования

Диффузионные методы включают также этап наложения дисков или полосок Е-теста на плотную питательную среду.

Приготовление питательных сред для определения чувствительности

Приготовление инокулюма из агаровой культуры. Для приготовления инокулюма используют чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту МакФарланда. Инокулюм следует использовать в течение 15 минут после приготовления.

Приготовление инокулюма из бульонной культуры. При определении чувствительности быстро растущих бактерий с обычными питательными потребностями для приготовления инокулюма также можно использовать 5-6 часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0–5,0 мл жидкой неселективной питательной среды. Инкубируют при 35⁰С. Примерно через 5-6 ч инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по МакФарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора.