260200.68 Продукты животного происхождения / Технология мяса и мясопродуктов
Форма подготовки очная
г. Владивосток
2012
Лабораторные работы 2 семестр (50 ч)
(50 ч в том числе в форме активного обучения – 24 часа)
МОДУЛЬ 1. Изучение свойств молочнокислых бактерий и бифидобактерий (12 часов)
Тема 1.1 Исследование биохимической активности молочнокислых бактерий L. plantarum8П-А3 и бифидобактерий (8 часов).
Лабораторная работа №1 Методы исследования таксономической принадлежности пробиотических штаммов
Таксономическая принадлежность штаммов устанавливается на основе полифазного таксономического подхода, использующего комплекс генотипических и ключевых фенотипических тестов, что позволяет с наибольшей степенью точности установить принадлежность микроорганизмов к таксону на уровне вида и штамма.
Исследования проводятся при использовании контрольных (референтных) штаммов данного вида из официальных депозитариев.
Микробиологические исследования фенотипических свойств штаммов
На данном этапе идентификации определяются основные фенотипические признаки чистой культуры штамма: культуральные свойства колоний, морфология клеток в микроскопических препаратах (в живом и зафиксированном виде), отношение к окраске по Граму, способность к спорообразованию, а также каталазная и нитратредуцирующая активность при использовании общепринятых в микробиологии методов анализа.
Чистую культуру штамма выделяют на рекомендованной для данного вида микроорганизмов питательной среде, позволяющей получать изолированные колонии. Например, выделение чистой культуры лактобактерий должно осуществляться со среды MRS, термофильных стрептококков – со среды типа М17 по ГОСТ Р 51331-99, бифидобактерий – со среды Блаурокка, среды для бифидобактерий или тиогликолевой среды.
Потенциальные пробиотические штаммы должны обладать типичными для рода культуральными признаками на всех типах сред (твердых, полужидких и жидких) без признаков диссоциации, а также однородными морфологическими, тинкториальными свойствами, окрашиваться по Граму положительно, не иметь спор и капсул, не восстанавливать нитраты, не продуцировать каталазу.
Биохимические исследования фенотипических свойств штаммов
Исследования проводятся для подтверждения принадлежности к роду и дифференциации видов. Оптимальными для данной цели являются методы идентификации микроорганизмов с помощью биохимических диагностических тест-панелей одноразового пользования отечественного и зарубежного производства, зарегистрированных в РФ в установленном порядке.
Для лактобактерий анализируется профиль ферментации расширенного набора углеводов и аминокислот (не менее 49 наименований).
Биохимическая идентификация бифидобактерий включает рутинную предварительную дифференциацию с определением их ферментативного профиля по укороченному спектру углеводов и многоатомных спиртов: лактоза, глюкоза, ксилоза, целлобиоза, рамноза, инулин, манноза, маннит, сорбит, инозит. С этой целью используют 1%-ные растворы десяти вышеперечисленных углеводов, приготовленные на основе полужидкой питательной среды (пептон – 10 г, кукурузный экстракт – 30 мл, цистин солянокислый – 0,2 г, хлористый натрий – 2,0 г, агар-агар – 0,75 г на 1 л дистиллированной воды и соответствующего индикатора pH).
После проверки чистоты культуры с помощью микроскопии с поверхности агаровой пластины снимают выросшие колонии петлей и ресуспендируют стерильном растворе хлорида натрия для получения взвеси, содержащей 1 миллиард клеток бактерий в 1 мл по стандарту мутности (ОСО 42-28-59-85). Полученную взвесь бактерий в количестве 0,01 мл вносят в 1 мл основы (т.е.7 концентрация взвеси клеток в основе среды равна 10).
Растворы тестируемых углеводов и многоатомных спиртов вносят по 0,1 мл каждого в ряд лунок планшета для иммунологических исследований. В каждую из лунок затем добавляют по 0,1 мл взвеси испытуемой культуры бифидобактерий. В последнюю очередь в каждую лунку добавляют по 1 капле стерильного вазелинового масла. Для контроля среды в одну лунку помещают по 0,1 мл основы среды, по 0,1 мл взвеси испытуемой культуры и по 1 капле вазелинового масла. Для контроля жизнеспособности культуры во взвеси ее вносят в БС-среду.
Все посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 ч в анаэробных условиях, после чего осуществляют предварительный учет результатов; окончательно результаты учитывают через 48 ч.
Результаты учитывают по изменению окраски среды в лунках: положительный результат – желтое окрашивание, отрицательный – фиолетовое.
Детальное изучение биохимических свойств штаммов, показавших положительные реакции с соответствующими субстратами, изучают при использовании параллельно трех биохимических тест-систем:
а) типа API-20CHL (bioMerieux, Франция);
б) типа API-50CHL (bioMerieux, Франция);
в) типа АНАЭРОтест 23 (PLIDA-Lachema diagnostica s.r.o., Чехия).
Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды
А) аппаратура и инструментарий
Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH +/- 0,01 ГОСТ 19881-74
Шкаф сушильный стерилизационный
ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °С ТУ 64-1-28-70-76
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 28…37 °С с отклонением от заданной +/- 1 °С ТУ 64-1-1382-72
Баня водяная с подогревом ГОСТ 12026-76
Весы лабораторные общего назначения 2 и 4 класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104-88
Микроскоп биологический МБИ-2, МБИ-3, МБР-3 ГОСТ 8284-78
Стерилизаторы паровые медицинские и аналогичные ГОСТ 19569-89Е
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной
воды в соответствии с ГОСТ 6709-72
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов ТУ 16-535-84
Холодильник бытовой электрический
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89
Скальпель хирургический, 15 см ГОСТ 21240-89
Микробиологические петли
Штативы для пробирок
Часы механические сигнальные ГОСТ 3145-84
Микроволновая печь
Б) лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76
Бутыли стеклянные для химических реактивов
Кастрюли эмалированные ГОСТ 24778-81
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости ГОСТ 1770-74
Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81
Полистироловые планшеты U-образные
Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82
Стекла предметные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75
Ступка фарфоровая с пестиком ГОСТ 9147-80
Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С
(цена деления шкалы 1 °С) ГОСТ 13646-68
Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932-90
Книга-каталог кодов или комплект программного обеспечения для идентификации
Бланки для регистрации результатов
Микробиологические петли
Фломастеры-маркеры
В) реактивы и питательные среды
Агар микробиологический ГОСТ 17206-84
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
D-глюкоза, ч ГОСТ 6038-79
D-лактоза, 1-водная ТУ 6-09-22-98-79
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198-75
Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493-75
Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328-77
Масло иммерсионное для микроскопии ГОСТ 31739-78
Набор реактивов для окраски по Граму
Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300-87
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-2000
Экстракт дрожжевой Триптон
Антибиотики разных групп
Диски с антибиотиками.
Реактивы производства разных фирм, прошедшие государственную
регистрацию и разрешенные для использования в установленном порядке.
Г) питательные среды
Среды для выращивания бифидобактерий, молочнокислых и НД изготовителя пропионовокислых бактерий: ГМС, М17, MRS, БС-среда (для культивирования и выделения бифидобактерий, НИИ ПМ, г. Оболенск)
Д) тест-панели для идентификации культур
API-20CHL и API-50CHL по спецификации изготовителя
АНАЭРОтест 23 по спецификации изготовителя
Е) стандарт мутности по McFarland или ОСО.
Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29 000.
Методика проведения биохимической идентификации штамма
Из чистой 18…24-часовой культуры готовят суспензию в стерильной дистиллированной воде. Суспензию тщательно гомогенизируют. Суспензию доводят до определенной мутности по шкале McFarland в зависимости от вида исследуемого штамма. Неправильно приготовленная суспензия (слишком густая или очень жидкая) может привести к получению ложных результатов.
Параллельно суспензию штамма или контрольного штамма высевают на питательные среды для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств и/или постановки дополнительных тестов.
Планшет для идентификации извлекают из упаковки и на прилагаемом к планшету бланке регистрируют номер испытуемого штамма и контрольного штамма.
Суспензию бактерий тщательно встряхивают и в каждую лунку инокулируют определенный объем суспензии (0,1…0,2 куб. см) в зависимости от требований фирмы-изготовителя и вида исследуемого штамма.
После инокуляции в ряд лунок может добавляться стерильное вазелиновое масло, полностью закрывающее внесенную суспензию клеток для создания анаэробных условий.
После инокуляции планшет накрывают крышкой и инкубируют 5…24 ч при оптимальной температуре для исследуемого вида (например, 42 °С – лактобациллы).
По окончании инкубации результаты учитывают визуально, отмечая цвет каждой лунки, и заносят в прилагаемые бланки.
В некоторые лунки (например, для ферментации индола) могут быть добавлены реактивы. Учет результатов на бета-галактозидазу проводят дважды: через 3…5 и 18…24 ч.
Идентификацию проводят с помощью таблиц, книг-каталогов кодов, компьютерного обеспечения соответствующих фирм-изготовителей, в заключении, учитывая данные, полученные по п. 5.1.1, указывают род и вид штамма.
Тестирование биохимических свойств используют для проверки стабильности фенотипических свойств штамма. Для этого культуру подвергают пассированию на жидких и плотных питательных средах и повторному через 3…5 пассажей тестированию биохимических свойств. Трехкратное совпадение всех исследованных биохимических реакций, выявленное при пассировании культур (не менее 10 пассажей), свидетельствует о стабильности фенотипических признаков. Вариабельность результатов по 1…2 реакциям свидетельствует о необходимости постановки дополнительных тестов на стабильность фено- и генотипических признаков штамма. Вариабельность результатов по большему числу реакций является свидетельством нестабильности фенотипических признаков и непригодности штамма для использования в пищевой промышленности.
Молекулярно-генетическое подтверждение таксономического статуса штаммов, установленного на основании фенотипических свойств
Для подтверждения таксономического положения штамма разработчик должен представить информацию об уровне его гомологии с штаммами этого вида, допущенными для использования в пищевой промышленности при создании аналогичной продукции. Разработчик (поставщик) должен представить информацию о нуклеотидной последовательности не менее двух локусов генома штамма, а также другие материалы, отражающие молекулярно-биологические характеристики.
Методика молекулярно-генетического анализа таксономической принадлежности бифидобактерий
Принцип метода.
Молекулярно-генетическая идентификация штаммов молочнокислых бактерий базируется на определении последовательностей информационного гена 16S рРНК и фрагментов операционных генов, кодирующих ферменты у бифидобактерий. Поскольку филогения по 16S рРНК в значительной степени соотносится с эволюционной историей организмов, формируемые группы по последовательности гена 16S рРНК, как правило, подтверждаются данными анализов фенотипических свойств. Для более детальной штаммоспецифической идентификации используется подход двухлокусного секвенирования, в частности, с использованием бета-субъединицы F F АТФазы или гена 0 1 трансальдолазы в случае отсутствия ПРЦ-фрагментов с видоспецифическими праймерами.
Оборудование, материалы, лабораторная посуда, реактивы
А) аппаратура и инструментарий
Анаэростат для анаэробного выращивания микроорганизмов или система газогенераторная настольная;
Термостат суховоздушный;
Высокоскоростная микроцентрифуга;
Микротермостат «Термит»;
Амплификатор типа «Терцик» или РТС-0150;
Камера для горизонтального электрофореза «SE-2»;
Источник питания;
Трансиллюминатор ТСР-20 МС.
Б) питательные среды
Бульон и агар МРС с 0,5 % цистеина.
В) реактивы и материалы
Трис HCl
ЭДТА
NaCl
Тритон-X100
Саркозил
Додецилсульфат натрия (SDS)
Фенол
Оксихинолин
Хлороформ
Изоамиловый спирт
Изопропанол
Этиловый спирт
Уксусная кислота, агароза, этидиум бромид, бромфеноловый синий, ксиленцианол, глицерин, лизоцим, РНКаза, протеиназа К, ДНК-маркер – ДНК фага лямбда/EcoRI+HindIII маркер («Fermentas», Литва).
Набор «Амплификация»: 10 х ПЦР буфер, 2,5 mM SUM dNTPs, 50 mM MgCl,
Фермент Taq-полимераза (5 ед./мкл), минеральное масло (Компания «Dialat Ltd», Россия);
набор для выделения фрагментов из агарозного геля QIAquick Gel Extraction Kit (фирма «Qiagen»).
Ход определения
1. Условия выращивания. Культуру бифидобактерий выращивают в высоких пробирках с 20 мл бульона в анаэростате в течение 48 ч при 37 °С.
2. Выделение геномной ДНК из Bifidobacterium. На данной стадии проведения анализа проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций и получение раствора ДНК или РНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации. Выбор методики выделения ДНК (РНК) в основном определяется характером обрабатываемого материала. За основу взят метод выделения ДНК из клеток бифидобактерий Regnault B. et al.; модифицированный метод разработан в лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.
Методика выделения. Культуру бактерий центрифугировать при 8000 об./мин. в течение 10 мин. Осадок суспендировать в 0,6 мл буфера TEST (трис HCl pH 8,0 10 mM; ЭДТА pH 8,0 5 mM; NaCl 1 M; Тритон-X100 1/200 объема). Осторожно перемешать. Инкубировать при 37 °С в течение 12 ч. Добавить 150 мкл свежеприготовленного раствора лизоцима (исходная концентрация 100 мг/мл); добавить 10 мкл раствора РНКазы (исходный раствор 10 мг/мл). Осторожно перемешать. Инкубировать при 37 °С в течение 3 ч (суспензия должна стать слегка вязкой). Добавить 150 мкл раствора протеиназы К (исходный раствор 20 мг/мл) и 150 мкл 10%-ного саркозила. Осторожно перемешать. Инкубировать при 37 °С в течение 24 ч до полного лизиса. Добавить 100 мкл 25%-ного додецилсульфата натрия, перемешать, инкубировать при 55 °С в течение 2,5 ч (суспензия должна посветлеть). Очистку ДНК следует проводить в эппендорфах объемом 2 мл. К лизату клеток добавить 1 объем фенола (свежеперегнанный фенол предварительно насытить сначала трис HCl pH 8,0 1 M, а затем трис HCl pH 8,0 0,1 M, добавить оксихинолин). Содержимое эппендорфа интенсивно, но осторожно перемещать переворачиванием в течение 1 мин. Центрифугировать 10 мин. при 12000 об./мин. Водную фазу отобрать в новый эппендорф, обработку фенолом повторить. Водную фазу отобрать в чистый эппендорф и добавить 1 объем хлороформа с изоамиловым спиртом (24 хлороформа:1 изоамилового спирта). Содержимое эппендорфа перемещать переворачиванием в течение 1 мин. Центрифугировать 5 мин. при 12000 об./мин. Водную фазу перенести в чистый эппендорф, добавить 1 мл изопропанола, перемешать переворачиванием (появится осадок в виде тяжей). Центрифугировать в течение 1 мин. при 10000 об./мин., удалить супернатант. Осадок промыть 70%-ным этиловым спиртом, высушить и растворить в 150 мкл воды.
Учет результатов. Результаты исследования учитываются путем анализа исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле.
3. Амплификация ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. ПЦР позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (несколько десятков пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного количества нуклеотидных последовательностей иной природы, и быстро размножить его. По сути дела метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследователю. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами – короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18…30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двухцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После гибридизации матрицы с праймером (отжиг) последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы. Важнейшая характеристика праймеров - температура плавления (T) комплекса праймер-матрица. Она определяется как m температура, при которой праймер присоединился к половине возможных сайтов связывания. Tm можно приблизительно определить по формуле:
Tm = 2 х (nA + nT) + 4 х (nG + nC),
где nX – количество нуклеотидов X в праймере.
Если праймер короткий и Tm мала, то праймер может оказаться частично комплементарен другим участкам m матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °С.
Обычно при проведении ПЦР выполняется 20…35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий:
1. Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94…96 °С (или до 98 °С, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5…2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись.
2. Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4…5 °С ниже их температуры плавления. Время стадии – 0,5…2 мин.
3. Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это – стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °С. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.
После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7…10 мин.
Подготовка к анализу.
Состав смеси для ПЦР (на 100 мкл): 10 мкл 10 х ПЦР буфера, 10 мкл смеси 2,5 mM SUM dNTPs, 4 мкл 50 mM MgCl2, 300 нг геномной ДНК и 0,8 мкл фермента Tag-полимеразы. Олигонуклеотидные праймеры добавляют в концентрации 20 пмоль на 100 мкл смеси.
Проведение исследования.
Параметры ПЦР реакции: денатурация геномной ДНК при 95 °С в течение 5 мин.; затем 30 циклов амплификации: 94 °С в течение 1 мин. (денатурация), 56…58…60 °С (в зависимости от праймеров) в течение 1 мин. (отжиг олигонуклеотидов), 72 °С в течение 2 мин. (достройка (элонгация) цепи); финальная элонгация фрагментов при 72 °С в течение 10 мин., хранение при 4 °С.
5. Визуализация результатов методом электрофореза в агарозном геле. Результаты исследования учитываются путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле.
Для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) применяют метод ДНК-электрофореза в агарозном геле. Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно, и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. После разделения (краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах. Определение размеров производят путем сравнения полученных фрагментов с коммерчески доступными препаратами ДНК (ДНК-маркерами), содержащими линейные фрагменты ДНК известной длины.
Подготовка к анализу
А. Приготовление агарозного геля: 0,8 – 2,0%-ную суспензию агарозы в буфере для электрофореза доводят до кипения и охлаждают до 45 °С, добавляют этидиум бромид до концентрации 0,5 мкг/мл. Заливают в специальную форму с гребенкой и дают затвердеть, гребенку осторожно вынимают и форму с гелем переносят в аппарат для горизонтального электрофореза и погружают в буфер.
Б. Приготовление 1 л 10-кратного ТАЕ буфера для электрофореза: навеску 4,04 г Трис растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5 M раствора ЭДТА pH 8,0 и доводят объем буфера до 1000 мл дистиллированной водой. Для проведения электрофореза 10-кратный ТАЕ буфер разводят дистиллированной водой в 10 раз.
Проведение исследования
В пробирки с исследуемыми образцами после завершения амплификации вносят аккуратно под масло 1/5 объема раствора, содержащего 0,25% раствора бромфенолового синего и 0,25% раствора ксиленцианола в 50%-ном глицерине, перемешивают наконечником для пипеточных дозаторов и 8 мкл полученного образца вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребенки. Электрофорез проводят при напряжении 120 вольт в течение 60 мин. За это время краситель успевает пройти не менее половины геля.
Учет результатов электрофореза. Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результаты реакции выявляются в виде светящихся красноватых полос. Положительными считаются пробы, содержащие фрагменты необходимой длины (1550 нуклеотидов).
6. Выделение и очистка амплифицированной ДНК. Проводят с использованием наборов для выделения фрагментов из агарозного геля (типа QIAquick Gel Extraction Kit фирмы "Qiagen") согласно протоколу изготовителя.
7. Определение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, трансальдолазы и бета-субъединицы F0 F1 АТФазы. Проводят по методу Сэнгера
Анализ таксономической принадлежности бифидобактерий проводят с использованием компьютерной программы Blast Для сравнения последовательностей генов рибосомальных РНК у бифидобактерий используют последовательности этого гена, характерные для разных видов Bifidobacterium, депонированные в GenBank NCBI. Сравнение последовательностей проводят с использованием программы ClustalW
Лабораторная работа №2 Методика молекулярно-генетического анализа таксономической принадлежности лактобактерий
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК для идентификации видовой принадлежности Lactobacillus spp.
Сущность метода.
Секвенированием ДНК называют комплекс методов, позволяющих определить нуклеотидную последовательность ДНК или ее фрагментов. Для идентификации и классификации бактерий определяют нуклеотидную последовательность наиболее консервативных участков бактериального генома. Изучение полных нуклеотидных последовательностей отдельных генов дает дополнительную информацию об эволюции таксона. Родственные представители обычно обладают гомологичными по последовательности генами. Поэтому на данный момент таксономия базируется в основном на данных секвенирования малой субъединицы рРНК как наиболее информационном виде анализа (Ботина и др., 2005, 2007).
Оборудование, материалы, лабораторная посуда, реактивы.
А. Реактивы:
50 ммТрис-HCl
10 мм ЭДТА-Na2
хлороформ
лизоцим
РНКаза
10 % SDS
5 М NaCl
фенол
изопропанол
деионизированная вода
Taq-полимераза
праймеры (фирма «Синтол»)
агароза.
Б. Оборудование:
термостатный бокс для выращивания микроорганизмов
центрифуга
центрифуга вортекс
водяная баня
амплификатор Omn-E фирмы Hybaid
камера для электрофореза.
Выделение ДНК
Выращивание всех штаммов лактобактерий проводят в жидкой стандартной среде МРС при 37 °С в течение 24…48 ч.
Клетки из 14 мл культуры осаждают центрифугированием при 4400 g в течение 12 мин. И ресуспендируют в 7 мл буфера 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА-Na2, pH 8,0. Суспензию клеток центрифугируют в тех же условиях и осадок ресуспендируют в 500 мкл указанного выше буфера; суспензию переносят в 2-мл центрифужную пробирку и добавляют 50 мкл хлороформа. Смесь энергично встряхивают с помощью вортекса (5 раз по 10 сек.), вносят 100 мкл лизоцима (60 мг/мл) и инкубируют 30 мин. при 37 °С; затем добавляют 6 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и инкубируют еще 30 мин. при 37 °С. Для лизиса клеток суспензию мягко смешивают с 200 мкл 10% ДСН (SDS) и 200 мкл 5 М NaCl; смесь инкубируют 16 ч при 65 °С. Полученный грубый лизат клеток остужают до комнатной температуры, добавляют 1 мл смеси фенол/хлороформ (1:1) и тщательно смешивают в течение 5 мин. до состояния гомогенной эмульсии; смесь центрифугируют при 12000 g 15 мин. Водную фазу, содержащую ДНК, отбирают в новую 1,5-мл пробирку и смешивают с 600 мкл изопропанола. Смесь инкубируют 30 мин. при комнатной температуре и центрифугируют при 12000 g 20 мин. Осадок ДНК трижды промывают порциями по 0,5 мл 75%-ного этанола (центрифугирование по 5 мин. при 12000 g) и растворяют в 100 мкл деионизованной воды. ДНК хранят при минус 20 °С.
Анализ 16S рибосомной нуклеиновой кислоты.
1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Гены 16S рРНК амплифицируют с помощью ПЦР с использованием праймеров 27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1492r (GGTTACCTTGTTACGACTT) [Lane, 1991].
Каждую реакцию проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкг хромосомной ДНК, по 20 пмоль праймеров, 200 мкм каждого dNTP, 1,5 мм MgCl2,50 мм KCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,8) и 1,25 единицы активности Taq-полимеразы. Реакцию проводят в амплификаторе Omn-E фирмы Hybaid.
Сначала образцы ДНК подвергают денатурации при 94 °С в течение 5 мин. Затем проводят 35 циклов, включающих денатурацию ДНК при 94 °С в течение 30 с, отжиг праймеров при температуре 55 °С в течение 40 с и полимеразную реакцию в течение 1 мин. Заключительный этап элонгации проводят при 72 °С в течение 4 мин. Праймеры для ПЦР синтезируются по предварительному заказу в специализированном предприятии (ООО «Синтол», РФ).
2. Электрофорез ДНК в агарозном геле и выделение ДНК из геля
Гель-электрофорез ДНК проводят в горизонтальном 0,7%-ном агарозном геле в трис-ацетатном буфере при напряженности электрического поля 5 В/см, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Для определения размеров фрагментов ДНК в качестве стандартов используют ДНК-маркер типа GeneRulerTM DNA Ladder Mix SM0331 фирмы Fermentas.
Фрагменты ДНК выделяют из геля методом электроэлюции на полоску DEAE бумаги Serva. Бумагу вставляют перед полосой фрагмента в прорезь в геле и проводят электрофорез в течение 7 мин. при 10 вольт/см. Бумагу со связавшейся с ней ДНК помещают в 500 мкл 2 М раствора NaCl и инкубируют 40 мин. при 65 °С. После удаления бумаги ДНК осаждают из раствора 1 мл 96%-ного этанола. Осадок ДНК промывают 2 раза 70%-ным этанолом и растворяют в 40 мкл буфера ТЕ.
3. Секвенирование ДНК
Секвенирование фрагментов ДНК проводится в специализированном предприятии на базе Центра коллективного пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН) с помощью набора реактивов ABI PRISM(R) BigDyeTM Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems.
4. Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК
С целью идентификации видовой принадлежности исследуемые последовательности ДНК анализируют на сходство с известными последовательностями генов 16S рРНК в базе данных GeneBank с помощью программы BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) [Zhang et al., 2000].
Идентичность последовательностей устанавливают на основе статистической значимости совпадений последовательностей. Дополнительный анализ последовательностей проводят с помощью их выравнивания с использованием программы Clustal X
|
