Выделение ЛСК из концентрата КЖ с помощью аффинной хроматографии («batch»-метод).
КонА-сефарозу отмывали трехкратно в равных объемах PBS (рН=8,2). Убирали надосадок и добавляли концентрат КЖ культуры L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) клон 3. Инкубировали 24 часа при комнатной температуре. По истечении суток надосадок удаляли, а конА-сефарозу трехкратно отмывали PBS (рН=8,2). Далее добавляли ФР (рН=3,0) и инкубировали 3 часа при комнатной температуре. Собирали надосадок и с помощью раствора NaOH доводили его до рН=7,2. Наличие ЛСК контролировали с помощью реакции кольцепреципитации.
4. Результаты экспериментальных и теоретических исследований
Морфологические, культуральные и биохимические свойства лактобактерий
Характеристики лактобактерий.
При световой микроскопии клетки представляют собой неподвижные грамположительные палочки от 0,7 до 3,0 мкм в длину, располагающиеся беспорядочными скоплениями и отдельными короткими цепочками. Жгутиков не имеют, капсул и спор не образуют. Лактобактерии являются факультативными анаэробами (микроаэрофилы). Слабо растут на воздухе, лучше – при пониженном содержании кислорода. Рост обычно стимулируется добавлением 5% СО2. Хемоорганотрофы; нуждаются в богатых сложных средах [12]. Через 48 часов на среде МРС-4 образуют беловатые, непрозрачные, непигментированные выпуклые, полупрозрачные колонии с ровным краем. В жидкой среде растут в виде гомогенного осадка и равномерной мути. Метаболизм бродильного типа, сахарокластический. Биохимические характеристики лактобактерий варьируют в зависимости от вида микроорганизма, но в общей массе последние способны ферментировать глюкозу с образованием кислоты и газа, хорошо разлагают мальтозу, лактозу, галактозу, слабо - сахарозу и маннозу, не сбраживает сорбит, рамнозу, целлобиозу, салицин и маннит, обладают высокой антагонистической активностью в отношении ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (шигелла Флекснера и Зонне, энтеропатогенной кишечной палочки, гемолитического стафилококка, протея).
Морфологические свойства.
Лактобактерии при окрашивании по Граму представляют собой грамположительные палочки 0,7-5,0 мкм в длину, в мазке располагаются короткими цепочками или беспорядочно. Спор не образуют.
Культуральные свойства.
На плотных средах МРС лактобактерии образуют чаще всего беловатые колонии 1-3 мм в диаметре, округлой формы с ровными или волнистыми краями. Такой тип колоний формировали все виды лактобактерий.
На жидкой среде МРС через 16-24 часа лактобактерии образуют гомогенный осадок с помутнением среды. По скорости роста в пробирках и на чашках с МРС - агаром исследуемые лактобактерии не отличаются.
Биохимические свойства.
Биохимические свойства лактобактерий изучались при помощи тест-системы API 50 CHL. Используя методику, описанную в разделе «методы» п.2, были протестированы оба вида лактобацилл (L.fermentum 90 TS-4 (21) и L.plantarum 8 RA-3. Результаты тестирования свидетельствуют, что исследуемые микроорганизмы относятся к роду Lactobacillus и отвечают биохимическим свойствам видов L.fermentum и L.plantarum. L.fermentum ферментирует сахара: рибоза, галактоза, глюкоза, фруктоза, маноза, мальтоза, лактоза, мелибиоза, сукроза, раффиноза, глюконат.
Агглютинационная активность культур по отношению к конА.
Некоторые виды лактобактерий имеют слущивающиеся поверхностные адгезины, взаимодействующие с конА. Благодаря этому свойству их можно выявлять и оценивать как в количественном, так и в качественном отношении.
В исследованиях демонстрирующих агглютинационную активность видов лактобацилл было установлено, что штамм L. fermentum 90-TS-4 (21) взаимодействует с кон-А до 8 разведения включительно с концентрацией последнего - 3,5*10-3мкг/мл. Данный результат перекликается с данными, полученными нами ранее [Анохина И.В., Кравцов Э.Г., Яшина Н.В. и др. Характеристика поверхностных адгезинов лактобактерий, используемых при изготовлении препаратов пробиотиков.// Бюл.экспер.биол.- 2006.- Т.141. №6.- С.664 -667.] и свидетельствует о постоянстве проявляемых свойств культуры.
Определение концентрации белка в КЖ методом Лоури [11].
В электронно-микроскопических исследованиях Granato D. et al. [19] показано, что лактобациллы окружены рыхлой микрокапсулой. Эта структура способна не только уходить с поверхности бактериальной клетки, но и пенетрировать в цитоплазматическое пространство. Используя метод определения белка по Лоури удалось показать, что в КЖ, лишенной микроорганизмов, количество белка может достигать 8450 мкг/мл.
Выделение и частичная очистка искомого продукта
Для получения исходного сырья L.fermentum 90 TS-4 (21) культивировали в стеклянной емкости объёмом 1 литр (при постоянном перемешивании). Супернатант КЖ очищали от низкомолекулярных компонентов и концентрировали путем диафильтрации на ячейках фирмы «AMICON» с использованием мембран UM-20 марки «Диафло». После сгущения и удаления низкомолекулярных компонентов концентрация белка составляла 64,0 мг/мл. Выход сухого вещества с 1 мл концентрата L.fermentum штамма 90 TS-4 (21) составил 82,0 мг. КЖ L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) преципетировали с конА в дозе 32,5 мг/мл.
Фракционирование такого концентрата, осуществленное путем ступенчатой диафильтрации на мембранах ХМ-300, ХМ-100 и UМ-20 установило, что фракция, активно преципитирующая конА, находится в образце, собранном над мембраной ХМ-100 (рис. 7). Это позволило заключить, что ЛСК представляет собой биополимер с молекулярной массой в пределах 100-300кДа.
Рисунок 7
Изучение свойства лектинсвязывающего комплекса
Концентрат КЖ был исследован с помощью иммуноэлектрофореза в агаровом геле. Разделение образца проводили при рН – 8,2; напряжении 200 В и силе тока 10 мА. В ходе исследования установлено, что в концентрате КЖ L.fermentum штамма 90 TS-4 (21) присутствуют две фракции, движущихся к катоду.
При проведении исследований в условиях движения ЛСК через «траншею», заполненную конА-сефарозой, компонент отсутствовал в фореграмме. Это факт явился основанием для выделения искомого продукта методом аффинной хроматографии («batch»-метод). В ходе исследований отмечено, что хроматографически очищенный на конА-сефарозе продукт, содержащий 150,0 мкг/мл белка, агрегативно не устойчив при значениях рН выше 6,0.
При установлении молекулярной массы данного компонента с помощью электрофореза в полиакриламидном геле было выявлено, что она колеблется в пределах от 25 до 30 кДа и примерно такие же параметры для ЛСК можно найти в ранее опубликованной работе Henriksson A. и Szewzyk R [21].
5.Заключение
При выполнении первого этапа научно-исследовательской работы удалось установить что:
1. Штамм L.fermentum 90 TS-4 (21), полученный из коллекции микроорганизмов ГИСК им.Тарасевича обладает морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами, соответствующими справочным данным литературы.
2. Культура L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) проявляет выраженную агглютинационную активностью в отношении КонА и реагирует с ним при концентрации последнего в растворе - 3,5*10-3мкг/мл.
3. КЖ, полученная при выращивании L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) на жидкой питательной среде представляет собой многокомпонентную систему. Количество белка в КЖ может достигать 8450 мкг/мл.
4. Использование для концентрирования КЖ метода диафильтрации на ячейках фирмы «AMICON» (мембрана UM-20 марки «Диафло») позволяет максимально сохранить лектинсвязывающий компонент клеточной стенки лактобацилл в составе концентрата надосадочной жидкости.
Результаты выполнения НИР могут быть использованы и применены в акушерско-гинекологической практике. Непосредственно при профилактике и лечение кандидозных вагинитов у беременных женщин и пациенток с манифестирующими воспалительными процессами грибковой (Candida albicans) этиологии. Кроме этого, результаты НИР могут быть базисом для создания пробиотического препарата на основе компонентов клеточной стенки бактерий и их продуктов жизнедеятельности, биосовместимых с конкордантными рецепторами эукариотических клеток.
Приложение 1
Список использованной литературы
Анкирская А.С. Бактериальный вагиноз.// Ж. акушерства и гинекологии- 1995 -6 – с.13-16
Багирова М.Ш., Коршунова О.В., Кафарская Л.И., Минкина Г.Н. Микрофлоро генитального тракта у больных с попиломавирусной инфекцией.// Ж. Микробиология. – 1995 – 3 – с.113-116
Бондаренко В.М. Характеристика и терапевтический потенциал пробиотиков по данным клинических испытаний. //Журн. Биопрепараты. – 2007 - №1 - С.11-15
Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Фрейдлин И.С. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М – 1994 -528 с
Борисов Л.Б., Кузьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. – М. – «Медицина» - 1993 – 239с.
Воробьев А.А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции / Журн. микробиологии. –1999.–№6. – С.102-105.
Далин М.В., Фиш Н.Г. Адгезины микроорганизмов. - Итоги науки и техники, ВИНИТИ: сер. Микробиология. - М – 1985 –т.16 – 107с.
Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз.//Автореф. дисс.д-ра мед. Наук – СПб – 1995 – 44с.
Соколова К.Я., Соловьева Н.В., Панова Е.В., Федотова М.Н. Новые подходы к изучению и оценке микробиоценозов влагалища.// Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция. – Горький – 1988 – с.5-10.
Черкасов С.В., Константинов О.Д. Антилизацимная активность и видовая характеристика микрофлоры репродуктивного тракта женщин во время беременности.// Ж..Микробиология. – 1996 -3- с.88-90
Под ред. Ф. Герхарда и др. Методы общей бактериологии: перев. с англ. // – М. – Мир – 1984 – т.2 – с.469
Определитель бактерий Берджи. Под редакцией Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейли и С.Уилльямса. 9 изд.Том 2 – Москва-«Мир»-1997.
Blaut, M., Collins, M. D., Welling, G. W., Dore, J., van Loo, J., and de Vos, W. (2002). Molecular biological methods for studying the gut microbiota: the EU human gut flora project. Br J Nutr 87 Suppl 2, S203-S211.
Bengmark S. Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic flora. Gut 1998, 42: 2-7
Bengmark S., Gianotti L. Nutritional support to prevent and treat multiple organ failur. World J Surg 1996, 20: 474-81
Brownlee A., Moss W. The influens diet on lactobacillus in the stomach of the rat. // J.Path. Bact. – 1961 -82 (2) – p.513-516
De Simone C. VSL#3 A probiotic preparation investigator brochure. 2001
Dembele T., Obdrzalek., Votava M. Inhibition of bacterial pathogens by lactobacilli. Zentralbl Bacteriol 1998, 288: 395-401
Granato D., Bergonzelli G.E., Pridmore R.D., Marvin L.,Rouvet M. Cell Surface-associated Elongation Factor Tu Mediates the Attachment of Lactobacillus johnsonii NCC533 (La1) to Human Intestinal Cells and Mucins. // J. Infec. and Immun. – 2004 – p. 2160-2169
Granato D., Perotti F., . Masserey I. et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. // Appl Environ Microbiol. 1999. V.65. P.1071-1077.
Henriksson A., Szewzyk R. Characteristics of the adhesive determinants of Lactbacillus fermentum 104 // App. and Environmental Microbiol. – 1991 – p. 499-502
Heinemann C., van Hylckama Vlieg J.E., Janssen D.B., Busscher H.J., van der Mei H.C. Reid G. // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 190. P. 177-180.
Jean-Christophe Boclé. Effets des probiotiques et prébiotiques sur la flore et l'immunité de l'homme adulte. AFSSA.2005. p.128- ISBN 2-11-095439-6
Lepargneur J.P., Rousseau V. Rôle protecteur de la flore de Doderleïn. J Gynecol Obstet Reprod 2002, 31 : 485-494
Mangin, I., Bonnet, R., Seksik, P., Rigottier-Gois, L., Sutren, M., Bouhnik, Y., Neut, C., Collins, M. D., Colombel, J.-F., Marteau, P., and Dore, J. (2004). Molecular inventory of faecal microflora in patients with Crohn's disease. FEMS Microbiology Ecology 50, 25-36.
Mack, D. R., Michail, S., Wei, S., McDougall, L., and Hollingsworth, M. A. (1999). Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression. Am.J Physiol 276, G941-G950.
McFarland L.V. Probiotics and C.difficile diarrhea. Am J Gastroenterol 2000, 95: 2128
Madsen K.L. The use probiotics in gastrointestinal disease. Can J Gastroenterol 2001, 15: 817-22
Nicand E., Cavallo J.D., Crenn Y., Meyran M. Scoring system for Gram stain diagnosis of bacterial vaginosis. // Path.Biol. – 1994 – 42(5) – p.539-543
Patterson J.A., Burkholder K.M. Application of prebiotics and probiotics in poultry production. Poult Sci 2003, 82: 627-31
Rani B., Khetarpaul N. Probiotic fermented food mixtures: Possible applications in clinical anti-diarrhoea usage. Nutr Health 1998, 12: 97-105
Rojas M., Ascencio F. and Conway L.P. Purification and characterization of a surface protein from Lactobacillus fermentum 104R that binds to porcine small intestinal mucus and gastric mucin // Appl Environ Microbiol. 2002- V.68 – p.2330-2336
Zoetendal, E. G., Akkermans, A. D., and De Vos, W. M. (1998). Temperature gradient gel electrophoresis analysis of 16S rRNA from human fecal samples reveals stable and host-specific communities of active bacteria. Appl Environ Microbiol 64, 3854-3859.
Suau, A., Bonnet, R., Sutren, M., Godon, J. J., Gibson, G. R., Collins, M. D., and Dore, J. (1999). Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Appl Environ Microbiol 65, 4799-4807.
Sorokulova I.B., Kirik D.L., Pinchuk I.I. Probiotics against Campylobacter pathogens. J Travel Med 1997, 4: 167-70
Schiffrin E.J., Brassart D., Servin A.L. et al. Immune modulation of blood leukocytes in humans by lactic acid bacteria: Criteria for strain selection. Am J Clin Nutr 1997, 66:515S-20S
Wilson, K. H., and Blitchington, R. B. (1996). Human colonic biota studied by ribosomal DNA sequence analysis. Appl Environ Microbiol 62, 2273-2278.
Elliott K.A. Managing patients with vulvovaginal candidiasis.// USA. Nurse Pract. – 1998 – 3 – р. 44-53.
Calderone R.A., Fonzi W.A. Virulence factors of Candida albicans.// Trends Microbiol. – 2001 – 9 – р. 327-335.
Sobel J.D. Pathogenesis and epidemiology of vulvovaginal candidiasis.// Ann. NY. Acad. Sci. – 1998 – 4 – р. 547-557.
|
