Учебно-методический комплекс дисциплины «Большой практикум»
|
Скачать 0.92 Mb.
|
|
Приготовление рабочих растворов.
К 100 мкл клеточной суспензии добавляют 300 мклтрис-солевого буфера с лизоцимом (10–20 мг/мл) до конечной концентрации лизоцима 1–10 мг/мл. Лизис ведут 15–60мин при 37°С. Затем добавляют 25 мклпротеиназы К (10 мл/мл) и инкубируют еще 15–30 мин при 60°С. Добавляют 10% SDS до конечной концентрации 1% SDS в растворе и выдерживают 10 мин при комнатной температуре. Перед экстракцией белков и полисахаридов можно добавить одну или две стадии замораживания-оттаивания. Для этого материал замораживают при –40С 30 мин и прогревают при 60С 20 мин. Белки и полисахариды экстрагируют фенолом и хлороформом: к водной фракции добавляют равный объем фенола, смесь взбалтывают 10–15 мин и центрифугируют на настольной центрифуге 10 мин на максимальных оборотах (12000 об/мин). Верхнюю водную фазу тщательно, без интерфазы отбирают, обрабатывают равным объемом смеси фенол:хлороформ (1:1) и центрифугируют10 мин (12000 об/мин). Затем водную фазу обрабатывают таким же образом равным объемом хлороформа. Процедуру обработки хлороформом следует повторить, если водная фаза содержит взвешенные частицы и непрозрачна. После этого к водной фазе добавляют 1/10 объема 3M ацетата натрия (pH 5,0) и 2 объема абсолютного этанола. ДНК осаждают в течение ночи при –20С, центрифугируют на настольной центрифуге на максимальных оборотах 30 мин (12000 об/мин). Промывают 70% этанолом, еще раз центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют, осадок подсушивают на воздухе и растворяют в ТЕ буфере или безбактериальной воде. Приготовление раствора хранения 10% SDS. Навеску 10 г SDS растворить на магнитной мешалке в 95 мл дистиллированной воды, довести окончательно объем в мерной колбе до 100 мл. Хранить при комнатной температуре. Додецилсульфат натрия выпадает в осадок при температуре ниже 15С, однако в этом случае раствор хранения можно просто прогреть перед использованием.
Выделение ДНК методом цетавлоновой очисткибыло недавно предложено М.А. Грачевым с соавторами (2006). Этот метод дает стабильно хороший результат при выделении ДНК из большого количества биомассы. Для выделения ДНК к 50 мкл клеточной суспензии (в ТЕ буфере) добавляют 100 мкллизирующего буфера со СТАБ, гомогенизируют 10 мин при 60С, затем добавляют еще 150 мкл этого буфера и выдерживают 30 мин при 60С, периодически перемешивая. Смесь центрифугируют 5 мин на настольной центрифуге (12000 об/мин), супернатант переносят в новую пробирку, а осадок промывают 100 мкллизирующего буфера. Супернатанты объединяют и добавляют 5 мклпротеиназы К (10 мг/мл), смесь инкубируют 30 мин при 60С. Затем добавляют 1 мл 1% водного СТАБ, перемешивают и осаждаютцетавлоную соль нуклеиновых кислот замораживанием-оттаиванием. Осадок собирают центрифугированием (15 мин, на настольной центрифуге, 12000 об/мин), дважды промывают 300 мкл 1% водного цетавлона. Супернатант удаляют, а осадок подсушивают и экстрагируют этанолом (2 раза по 400 мкл) 10 мин при 60С, отделяя супернатант центрифугированием(30 мин, на настольной центрифуге, 12000 об/мин). К объединенному супернатанту добавляют 80 мкл 3М ацетата натрия (рН 5,0) и выдерживают ночь при –20С для осаждения нуклеиновых кислот. ДНК осаждают центрифугированием(30 мин, на настольной центрифуге, 12000 об/мин), промывают 70% этанолом, подсушивают на воздухе и растворяют в ТЕ буфере. Приготовление рабочего раствора.
Обычно для выделения суммарной ДНК используют набор для выделения ДНК QIAampBlood&tissue (QIAGENE) по прилагаемой к набору инструкции. Бактериальный осадок или смыв с фильтра суспендируют в 180 мклтрис-солевого буфера с лизоцимом (10 мг/мл). Суспензию инкубируют 30 мин при 37С. Добавляют 25 мклпротеиназы К (100 мг/мл) и 200 мкл буфера AL (из набора). Реакционную смесь инкубируют 30 мин при 70С и 30 мин при 95С. После этого добавляют 210 мкл абсолютного этанола, тщательно перемешивают, наносят на колонку и центрифугируют 1 мин(на настольной центрифуге, 12000 об/мин). Колонку дважды промывают буфером AW (из набора), центрифугируют 1 мин(на настольной центрифуге, 12000 об/мин). Для полного удаления остатков спирта повторяют центрифугирование в течение 3 мин(на настольной центрифуге, 12000 об/мин). ДНК элюируют буфером AE (из набора). Для этого буфер предварительно прогревают при 70С, наносят 200 мкл горячего буфера на колонку, выдерживают 1–5 мин и центрифугируют 5 мин(на настольной центрифуге, 12000 об/мин).
Выделение ДНК проводят с помощью наборов ДНК-сорб А и Б, а суммарные препараты нуклеиновых кислот получают с помощью набора РИБО-сорб (Амплисенс, Москва) по прилагаемой в наборам инструкции. К бактериальной массе объемом около 100 мкл добавляют 450 мкллизирующего буфера, тщательно перемешивают. Если в состав клеточной массы входит много взвешенных частиц, то перед добавлением сорбента желательно лизирующий раствор центрифугировать 10–15 мин на настольной центрифуге(12000 об/мин), надосадочную жидкость перенести в новую пробирку и добавить к ней 25 мкл сорбента. Суспензию тщательно суспендируют на вортексе, выдерживают при комнатной температуре 5 мин, периодически перемешивая. Центрифугируют 30 сек на настольной центрифуге (12000 об/мин), удаляютсупернатант и проводят серию отмывок в отмывочных буферах 1 и 3 строго по инструкции. Осадок ресуспендируют в 400 мкл раствора для отмывки 4, центрифугируют 30 сек на настольной центрифуге(12000 об/мин), супернатант удаляют и осадок подсушивают 30 мин при 48°С. Осадок хранят при комнатной температуре до элюции нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты элюируют в 50 мкл безбактериальной стерильной воды или ТЕ буфера. Для этого осадок тщательно суспендируют, прогревают в термостате 5 мин при 60°С и центрифугируют 5 мин на настольной центрифуге на максимальных оборотах(12000 об/мин). Надосадочную жидкость тщательно, без сорбента отбирают в новую пробирку и используют в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Для выделения ДНК лучше использовать суточные культуры бактерий. Клетки из жидкой культуры осаждают центрифугированием, а если биомассу наращивали на твердой среде, смывают с агаратрис-солевым буфером и осаждают центрифугированием. Бактериальный осадок промывают и суспендируют в 400 мклтрис-солевого буфера, содержащего 1 мг/мл лизоцима. Лизис ведут 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют10% SDS до конечной концентрации 1% SDS в растворе и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Дальнейшую обработку фенолом и хлороформом и осаждение бактериальной ДНК ведут, как описано выше при выделении ДНК ферментативным лизисом. ОсобенностиотдельныхметодоввыделенияДНК.
Амплификация – полимеразная цепная реакция, это многократное умножение фрагмента ДНК, ограниченного олигонуклеотиднымипраймерами-затравками (рис. 6, 7). Олигонуклеотиды – это одноцепочечные фрагменты ДНК длиной от 15 до 30 пар оснований. 1 этап – денатурация двухцепочечной ДНК температура – 94°С, время – 60 сек 2 этап – отжиг праймеров-затравок температура – 48–70°С, время – 60 сек 3 этап – элонгация, построение новой цепи ДНК по матрице старой ДНК температура – 72°С, время – 60–120 сек Рис. .Основные этапы полимеразной цепной реакции. Рис. .Процесс многократного умножения фрагмента определенной длины, ограниченного используемыми праймерами-затравками при полимеразной цепной реакции. Гибридной в данном случае является молекула ДНК, состоящая из одной цепи матричной ДНК и второй цепи вновь синтезированной ДНК с одной стороны ограниченной праймером-затравкой. Вновь синтезированная ДНК – это ДНК, состоящая из одной цепи ДНК, ограниченной прамером-затровкой только с одной стороны, а вторая цепь ограничена праймерами с двух сторон. Длина таких молекул ДНК длиннее, чем требуемого ПЦР-продукта. В ПЦР-продукте обе цепи ДНК ограничены праймерами-затравками с обеих сторон. В каждом последующем (после 3-го)цикле будет геометрически увеличиваться число именно этих фрагментов. Количество выделенной суммарной бактериальной ДНК оценивают спектрофотометрически и в полимеразную цепную реакцию берут от 1 до 10 нг ДНК. Следует отметить, что при постановке амплификации всегда необходимо ставить так называемый безматричный контроль реакции – в этом случае в реакционную смесь добавляют все компоненты, а в качестве матрицы используют воду. Этот контроль всегда должен быть отрицательным, что подтверждает чистоту используемых реагентов. Кроме того, при амплификации на парах групп-специфичных праймеров необходима постановка соответствующих положительных и отрицательных контролей. Эти контроли в качестве матриц подразумевают использование препаратов нуклеиновых кислот тех штаммов, с которыми ПЦР-продукт должен быть либо получен обязательно (положительный контроль), либо точно отсутствовать (отрицательный контроль). 2.1. Подбор пары праймеров Пару праймеров для амплификации выбирают в зависимости от поставленной задачи: для изучения максимального разнообразия микробного сообщество рекомендуется использовать пару наиболее консервативных бактериальных праймеров 500L–1350R (Денисова и др., 1999). Проверка этих праймеров с использованием базы данных RibosomalDatabaseProjectII (http://rdp.cme.msu.edu/) показала, что они действительно обладают высокой консервативностью. Нуклеотидные последовательности некоторых групп- и видо-специфичных бактериальных праймеров представлены в таблице 1. Кроме того, в таблице указаны филогенетические группы, которые могут быть определены с помощью той или иной пары праймеров и бактериальные штаммы, рекомендуемые в качестве положительных и отрицательных контролей из коллекции культур кафедры микробиологии Дальневосточного университета. 2.2.Подбор оптимальных условий амплификации Для оценки оптимальных условий амплификации необходимо определить следующие параметры реакции (1) концентрацию матричной ДНК; (2) температуру отжига и (3) количество циклов. В амплификацию берутследующие разведения суммарной бактериальной ДНК: 0,01; 0,1; 1 и 10мкг/мл. Для выявления оптимальной температуры отжига амплификацию ведут с градиентом температур от 50 до 72С. Количество циклов можно изменять от 20 до 45. Кроме того, следует учитывать с каким конкретно ферментом проводится амплификация. В настоящее время наряду с обычными термофильными TaqДНК-полимеразами широко используются ДНК-полимеразы, обладающие репарационными активностями, такие как Vent(exo+) или PfuДНК-полимеразы. Эти полимеразы за счет 3'–5' экзонуклеазной активности обеспечивают более высокую точность амплификации и низкую частоту ошибок, по сравнению с остальными термостабильными ДНК-полимеразами, но требуют дополнительного подбора условий амплификации. Для получения качественного ПЦР-продукта с этими полимеразами кроме вышеперечисленных параметров следует учитывать длину амплифицируемого фрагмента и концентрацию дНТФ. Таблица 1.Олигонуклеотидныепраймеры на основные филогенетические группы бактерий.
Амплификацию проводят в 25 мкл буфера для ПЦР, рекомендованного фирмой-производителем термостабильной Taq ДНК-полимеразы, добавляяоптимальную концентрацию матричной бактериальной ДНК, по 10 пмоль каждого праймера, 2,5 мМMgCl2 и 1–2 ед.акт. Taq ДНК-полимеразы. Для получения максимального разнообразия ПЦР-продуктов рекомендуется использовать следующий режим реакции (Денисова и др., 1999): 94С – 5 мин, 50С – 2 мин, 72С – 2 мин (1 цикл), 92С – 45 сек, 52С – 1,2 мин, 72С – 1,5 мин (2–10 циклы), 92С – 45 сек, 54С – 1,2 мин, 72С – 1,5 мин (11–20 циклы), 92С – 45 сек, 56С – 1,2 мин, 72С – 1,5 мин (21–30 циклы), 72С – 20 мин (31 цикл). Амплификацию на групп-специфичных праймерах проводятв следующем режиме реакции: денатурация – 94С, 45 сек; отжиг – температура варьирует в зависимости от конкретной пары праймеров, 45 сек; элонгация – 72С, 70 сек. В первом цикле матрицу денатурируют 5 мин, а в последнем цикле время элонгации увеличивают до 20 мин. Всего проводят 30 циклов амплификации. Следует отметить, что время элонгации при амплификации протяженных фрагментов (длиной более 1000 п.о.) может быть увеличено до 1,5–2 мин. Для амплификации ДНК чистых культур микроорганизмов используют пару праймеров 27L и 1350R (или 1492R), позволяющую получить практически полный ген 16SрРНК (длина амплифицированного фрагмента составляет более 1300 или 1450 п.о.). Режим реакции включает 30–40 стадий циклов: денатурация – 94С, 45 сек; отжиг – 52С, 70 сек; элонгация – 72С, 90 сек. 2.3.Очистка ПЦР-продукта для дальнейших экспериментов После амплификации ПЦР-продукты анализируют электрофорезом в 1 или 1,5% агарозном геле в 0,5×ТАЕ буфере. После окрашивания геля бромистым этидием(рабочая концентрация 2 мкг/мл) полосы, соответствующие по размеру вставкам фрагмента гена 16S рРНК, вырезают. Кусочки геля помещают в стерильные пробирки эппендорф и замораживают при –20С. Для элюции нуклеотидного материала фрагменты геля центрифугируют 15 мин на настольной центрифуге при максимальных оборотах, супернатант с ПЦР-продуктом отбирают и используют для лигирования или секвенирования. Приготовление раствора хранения 50×ТАЕ буфера. Навеску 121 г трис-основного растворить на магнитной мешалке в 400 мл дистиллированной воды. Оттитровать рН раствора до 7,6 ледяной уксусной кислотой, после чего добавить 50 мл 0,5М ЭДТА (рН 8,0) и довести окончательно объем в мерной колбе до 500 мл. Хранить при 4°С. Рабочий раствор 0,5×ТАЕ готовится непосредственно перед использованием. 50×ТАЕ буфер 2М трис-ацетат,рН 7,6 50мМ ЭДТА 2.4.Лигирование ПЦР-продукта в плазмидные вектора Для лигирования ПЦР-продукта принято использовать плазмидные вектора. Наиболее широко используемые наборы фирм Promegaи Fermentas. Лигирование ПЦР-продуктов в плазмидные вектора основано на особых свойствах термофильных ДНК-полимераз. Известно, что TaqДНК-полимеразы достраивают с высокой степенью вероятности дополнительную букву дA, и, таким образом, образуются ПЦР-продукты с липкими концами в одну букву А. Поэтому линейные плазмидные вектора содержат липкие концы с одной буквой дТ. Этого оказывается достаточным для комплементарного узнавания и сшивки концов ДНК-лигазой. Этот тип клонирования называется АТ-клонированием. С другой стороны, для уменьшения количества ошибок при амплификации в последнее время широко используют ДНК-полимеразы с корректирующей, 3'–5' экзонуклеазной активностью. Такие ДНК-полимеразы дают ПЦР-продукты с тупыми концами. Поэтому в настоящее время есть серия плазмидных векторов, предназначенных для тупого лигирования. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Например, в случае АТ-клонирования амплификационную смесь можно использовать в реакцию лигирования, без дополнительной очистки, но при этом количество колоний, содержащих плазмиду со вставкой, варьирует от 30 до 60% от общего числа выросших колоний. В случае тупого клонирования необходимо обязательно проводить очистку ПЦР-продукта, но при этом количество колоний, содержащих плазмиду со вставкой нужной длины, увеличивается. 2.5. Лигирование ПЦР-продуктов с липкими концами ДляклонированияПЦР-продуктов, содержащихфрагментгена 16SрРНК, используюттакиеплазмидыкакрАТ123 (ClonTech), pGEM-AT (Promega), pJET-AT (Fermentas).Для этого 50 нгплазмидного вектора лигируют с 3 мкл неочищенного ПЦР-продукта в 10 мкл реакционной смеси, содержащей лигазный буфер и 1 ед. акт. Т4 ДНК-лигазы соответствующей фирмы-производителя. Смесь инкубируют от 12 до 24 часов при 14С. 2.6.Лигирование ПЦР-продуктов с тупыми концами Новый набор GeneJETTMPCRCloningKitкомпании Fermentas предназначен для тупого лигирования. ПЦР-продукты с тупыми концами, полученными с помощью корректирующих ДНК-полимераз, могут быть сразу же лигированы с вектором для клонирования pJET1/blunt. ПЦР-продукты с 3'-дA выступающим концом, полученные с помощью Taq ДНК-полимеразы или другими термостабильными ДНК-полимеразами, затупляются с помощью высоко эффективного термостабильного фермента ДНК-blunding перед лигированием. Реакционный буфер для этой реакции оптимизирован как для затупления концов, так и для реакции лигирования. Оптимальное молярное отношение вставка:вектор – 3:1. Реакцию затупления концов ПЦР-продуктов, полученных с помощью Taq ДНК-полимеразы, проводят в лигазном буфере, поставляемом фирмой-производителем, добавляют 1–2 мкл очищенного ПЦР-продукта и 1 мкл фермента DNABlunting. Смесь тщательно перемешивают, центрифугируют 3–5 сек и инкубируют при температуре 70°С в течение 5 мин. Охлаждают во льду несколько секунд и сразу же ставят реакцию лигирования, добавляя 50 нг вектора pJET1/blunt и 1 мклТ4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь тщательно перемешивают, центрифугируют 3–5 сек и инкубируют 30 мин при комнатной температуре (22°С). После этого смесь можно использовать для трансформации клеток E.coli.
Введение плазмидной ДНК в клетки E.coli называется трансформацией. E.coli относится к тем микроорганизмам, которые не обладают физиологической компетентностью к поглощению экзогенных молекул. Поэтому для введения ДНК внутрь данной грамотрицательной бактерии необходимо создать условия, позволяющие преодолеть барьер клеточной стенки. Одним из первых таких методов стала система сферопластовE.coli, которые обычно получают путем обработки бактериальных клеток в изотоническом растворе лизоцимом. Лизоцим, эффективно гидролизующийпептидогликан грамположительных клеток, в тех же условиях не деградирует пептидогликановый слой грамотрицательных бактерий, поскольку не может проникнуть через внешнюю мембрану клетки. Липополисахаридный слой внешней мембраны грамотрицательных бактерий стабилизирован ионами двухвалентных металлов. Обработка комплексообразующим агентом ЭДТА позволяет частично денатурировать внешнюю мембрану, часть липополисахаридов высвобождается при этом, оставляя пептидогликановый слой доступным для лизоцима. Лизоцим расщепляет в пептидогликанегликозидную связь между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой. При этом полисахаридные цепи распадаются на дисахаридные остатки. Доказано, что молекулы ДНК проникают в сферопласты в нативнойдвухцепочечной форме. Более эффективным является метод трансформации CaCl2-зависимых клеток. Суть этого метода заключается в обработке культуры E.coli раствором CaCl2 на холоде (0°С) с последующим тепловым шоком при 37–42°С. Механизм индукции компетентного состояния обусловлен ионами Ca2+, которые могут индуцировать фазовый переход липидов внешней мембраны, благодаря чему она приобретает вместо обычной двухслойной необычную гексагональную конфигурацию. Этот переход происходит во время температурного шока и сопровождается поглощением плазмидных ДНК. Температура фазового перехода зависит от состава липидов внешней мембраны. Последующее охлаждение до 0°С также ведет к фазовому переходу липидов и молекулы ДНК снова могут проникать в клетки. При этом продолжительность этого фазового перехода длиннее. Фазовые нарушения затрагивают только внешнюю мембрану клетки, через плазматическую мембрану молекулы ДНК способны проникать и без теплового шока и бивалентных катионов. В настоящее время разработан и нашел широкое применение физический метод введения экзогенных молекул ДНК – электропорация. Суть этого метода заключается в том, что кратковременное воздействие (обычно 5–20 мс) электрического поля высокой напряженности (1–15 кВ/см) на внешнюю мембрану приводит к образованию в ней пор. Время существования и размер таких пор достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. 3.1.Приготовление компетентных клеток Компетентные клетки E.coli (штаммы Invα, JM-109) для трансформации получают, используя стандартную методику трансформации (Sambrooketal., 1989). Клетки E.coli поддерживают и хранят на чашках с минимальной средой М9. Для получения ночной культуры 2–3 отдельные колонии засевают в 50 мл среды SOB и инкубируют при 37С до титра 4–7×107 жизнеспособных клеток в 1 мл среды при постоянном перемешивании. Для определения титра жизнеспособных клеток можно использовать спектрофотометр. Клетки штаммов Invα иJM-109 выращивают до оптической плотности 0,22–0,3 (длина волны 590 нм). Значения оптической плотности и титр жизнеспособных клеток, до которых наращивают биомассу для приготовления компетентных клеток, обычно зависят от конкретного штамма, используемого в работе. Важным условием является использование клеток на определенной стадии роста, а именно в поздней логарифмической фазе роста. Далее все процедуры с клеткамиE.coli проводятво льду. Клеточную суспензию (1,5 мл) охлаждают 10–15 мин, центрифугируют на настольной центрифуге 30 сек(12000 об/мин). Супернатант сливают, а клетки суспендируют в 500 мкл TFB буфера и инкубируют 10–15 мин. Клеточную суспензию вновь центрифугируют 30 сек(12000 об/мин), ресуспендируют в 120 мкл TFB буфера, и дважды добавляют по 4,2 мкл раствора ДМСО в толщу суспензии, выдерживая смесь каждый раз по 15 мин во льду. Минимальная среда М9 (Sambrooketal., 1989) 0,6 г Na2HPO4 0,3 г KH2PO4 0,05 г NaCl 0,1 г NH4Cl 1,5 г агар Вода до 100 мл Стерилизуются отдельно и добавляются в стерильных условиях: 0,2 мл 1М MgSO4 0,1 мл 1М CaCl2 1 мл 20% глюкозы СредаSOB(Sambrooketal., 1989) 1 г триптон 0,25 г дрожжевой экстракт 250 мкл 2М NaCl 62,5 мкл 2М KCl Вода до 50 мл Отдельно стерилизуются и добавляются в стерильных условиях: 0,5 мл 1М MgCl2 0,5 мл 1М MgSO4 TFB буфер (Sambrook et al., 1989) 100 мМKCl 45 мМ MgCl2 10 мМ CaCl2 3 мМ HACoCl = Co[(NH3)6]Cl3
3.2.Тепловой шок и собственно трансформация Для трансформации в каждую пробирку с компетентными клетками добавляют по 3 мкллигазнойсмеси, тщательно перемешивают, выдерживают 30 мин и проводят «тепловой шок»: пробирки инкубируют на водяной бане при 42С 90 сек, после чего сразу же охлаждают во льду в течение 2 мин и в каждую пробирку добавляют по 800 мкл среды SOC. Для «оживления» клеток смесь инкубируют 45–60 мин при 37С и непрерывном перемешивании. Для бело-голубого скрининга колоний полученных после трансформации клеток лигазной смесью после АТ-лигирования клетки высевают на чашки Петри с твердой средой LB, содержащей 20 мкг/мл ампициллина и 0,05% X-gal. Для скрининга колоний после тупого лигирования в вектор pJET1/blunt клетки высевают на чашки Петри с твердой средой LB, содержащей 20 мкг/мл ампициллина. Чашки и в том, и в другом случае инкубируют ночь при 37С. Среда SOC(Sambrook et al., 1989) 50 мл cреды SOB 0,5 мл 20% глюкозы Среда LB(Sambrook et al., 1989) 0,5 г дрожжевой экстракт 1 г триптон 1 г NaCl 1,5 г агар Вода до 100 мл
Отбор клонов, полученных после АТ-лигирования, проводится методом «бело-голубого» скрининга (Sambrooketal., 1989). Бело-голубой скрининг клонов основан на работе гена синтеза β-галактозидазы. В случае, если плазмида зашивается ДНК-лигазой сама на себя, ген синтеза β-галактозидазы оказывается ненарушенным и клетки продуцируют этот фермент. В среду в качестве селективного маркера добавляется краситель X-gal, который разрушается β-галактозидазой с образованием окрашенного в синий цвет продукта. Таким образом, все колонии синего цвета содержат не нарушенный ген. Встройка экзогенного ПЦР-продукта происходит по сайту, локализованному внутри этого гена. Поэтому наличие встроенного ПЦР-продукта нарушает рамку считывания гена, и фермент не синтезируется. Следовательно, колонии, содержащие плазмиду со вставкой, окрашены в белый цвет. Клетки без плазмиды не вырастают, потому что плазмида несет ген устойчивости к ампициллину, и выращивание клеток на среде с ампициллином дает прямую положительную селекцию колоний, несущих плазмиду. Таким образом, отбирают все колонии белого цвета, подразумевая, что они несут плазмиду со вставкой. Набор GeneJETTMPCRCloningKitкомпании Fermentas для тупого лигирования – это система положительной селекции высоко эффективного клонирования ПЦР-продуктов, полученных с помощью Pfu ДНК-полимеразы, Taq ДНК-полимеразы или любой другой термостабильной ДНК-полимеразой. В набор входит высококопийный вектор для положительной селекции pJET1/blunt. Этот вектор содержит ген эндонуклеазы рестрикции, который летален для всех штаммов E.coli, обычно используемых для клонирования. Лигирование фрагмента ДНК в клонируемое положение разрывает этот летальный ген. Таким образом, только клетки, содержащие рекомбинантные плазмиды способны размножаться. В этом случае все выросшие колонии несут плазмиду со вставкой.
Выделение плазмидной ДНК проводят методом щелочного лизиса. Для этого клетки выращивают в жидкой среде LB при 37°С в течение ночи. Клеточную биомассу охлаждают 15–20 мин в холодильнике, центрифугируют на настольной центрифуге и суспендируют в 100 мкл буфера с ß-меркаптоэтанолом. Буфер с ß-меркаптоэтанолом 20 мМтрис-HCl, рН 8,0 10 мМ ß-меркаптоэтанол 2 мМ ЭДТА, рН 8,0 Добавляют 2 мкл этого же буфера с лизоцимом (концентрация 5 мг/мл) и 1 мкл 1% тритона Х-100 (в воде). Смесь инкубируют 30 мин во льду. Добавляют 200 мкл 1% SDS в 0,2МNaOH и инкубируют еще 15 мин при комнатной температуре. Добавляют 150 мкл 3М ацетата натрия (рН 4,8–5,0), выдерживают 1 час во льду, центрифугируют 5 мин на настольной центрифуге (12000 об/мин), осадок удаляют палочкой. К супернатанту добавляют 900 мкл абсолютного этанола, выдерживают 1–2 часа при –20°С, центрифугируют 5 мин (12000 об/мин), надосадочную жидкость удаляют. Осадок растворяют в 100 мкл воды, добавляют 100 мкл 5М LiCl в 50 мМтрис-HCl (pH 8,0) и инкубируют 15 мин во льду. Раствор центрифугируют 5 мин на настольной центрифуге (12000 об/мин), супернатант переносят в новую пробирку, добавляют 500 мкл абсолютного этанола и осаждают плазмидную ДНК 1–2 часа при –20°С. Раствор снова центрифугируют 5 мин (12000 об/мин), супернатант сливают, а осадок растворяют в 50 мкл ТЕ буфера. Плазмидная ДНК, выделенная этим методом, всегда содержит небольшое количество геномной бактериальной ДНК, поэтому амплификацию встроенного фрагмента следует проводить на универсальных плазмидныхпраймерах. Кроме того, плазмидная ДНК может быть использована для скрининга клонов, содержащих вставку, рестрикционным анализом. Для быстрого скрининга большого числа колоний мы используем метод «кипячения» клеток. Для этого биомассу клеток отобранных колоний переносят в пробирки эппендорф, содержащие 20 мкл 20 мМтрис-HCl (pH 7,5), суспензию клеток кипятят 5 мин, а затем замораживают. Такой лизат клеток после центрифугирования (15 мин, 12000 об/мин) можно сразу использовать в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции. Для скрининга клонов, содержащих вставку, проводят ПЦР с 1мкллизата «кипяченых» клеток, используя праймеры, комплементарные участкам плазмиды в районе вставки (M13-UP, GGAAACAGCTATGACCAT и M13-DOWN, GTAAAACGACGGCCAGTG). Условия реакции: 94С – 2 мин (1 цикл), 92С – 45 сек, 55С – 45 сек, 72С – 60 сек (2–30 циклы), 72С – 15 мин (31 цикл). Полученные продукты реакции анализируют электрофорезом в 1,5% агарозном геле. После окрашивания геля бромистым этидием полосы, соответствующие по размерам вставкам фрагмента гена 16S рРНК, вырезают и замораживают. Для элюции нуклеотидного материала таблетки геля центрифугируют, жидкость отбирают и используют для секвенирования, рестрикционного анализа или гибридизации.
Для успешного проведения реакции секвенирования желательно, чтобы ПЦР-продуктыбыли получены на той же паре праймеров, с которых будет проводиться сама реакция секвенирования. Для секвенирования на автоматическом секвенаторе ПЦР-продукты должны быть очищены от меченых аналогов, которые были использованы в реакции. Для этого ПЦР-продукты либо осаждают из реакционной смеси этанолом, либо проводят анализ и очистку из агарозного геля, как было описано выше (см. п. 3.3.). Результаты сиквенсной реакции с радиоактивной меткой можно анализировать после разделения ПЦР-продуктов в денатурирующем полиакриламидном геле. В этом случае ПЦР-продукты можно сразу же после сиквенсной реакции использовать для нанесения на форез.
Анализ полученных последовательностей проводят путем их сравнения с последовательностями международного EMBL-банка. Для этого используют базу данных и пакеты программ либо FASTA (http://www.ebi.ac.uk/fasta33), либо BLASTA (http://www2.ebi.ac.uk/blast2). Последовательности корректируют с помощью программы Bioedit, а для построения филогенетических древ используют пакеты программ Megav3.1, PAUP или ARB. Модуль IV. Идентификация микроорганизмов традиционными микробиологическими методами с применением определителя. Выделение штамма в чистую культуру. Постановка биохимических тестов для идентификации штамма. Использование для отработки техники планшет, пробирок, готовых тест-систем. Использование определителя Берги для чтения и интерпретации полученного результата. Решение задач на самостоятельное определение зашифрованного штамма.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 |
Учебно-методический комплекс дисциплины «Практикум на эвм» Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями государственного стандарта высшего профессионального образования... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины компьютерный практикум 010707.... Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс по дисциплине ситуационный практикум по налогообложению При разработке учебно –методического комплекса учебной дисциплины в основу положены |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «организационное поведение» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Торговое оборудование» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Русский язык и культура речи» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Системное программное обеспечение» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
 |
Учебно-методический комплекс дисциплины обсужден на заседании кафедры... Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины архитектура ЭВМ 090104. 65... Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «коммерческое право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «римское право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Таможенное право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «защита прав потребителей» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «иностранный язык по специальности» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |