 
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
МЕТОДИКА РЕГИСТАРАЦИИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙРОНОВ МЕТОДОМ «ПАТЧ-КЛАМП»
Учебно-методическое пособие
Рекомендовано методической комиссией биологического факультета для студентов ННГУ, обучающихся по направлению 020400.62 «Биология», по профилю "Биофизика"
Нижний Новгород
2012
УДК 612:57.087 (075.8)
ББК Е 707+Ес (я 73)
М 54
М 54 МЕТОДИКА РЕГИСТАРАЦИИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙРОНОВ МЕТОДОМ «ПАТЧ-КЛАМП». Авторы: Дембицкая Ю.В., Лебедева А.В., Тюрикова О. В., Семьянов А.В.: учебно-методическое пособие /Нижний Новгород: Издательство Нижегородского государственного университета, 2012. – 27с.
Рецензент: д.б.н., В.А. Воденеев
Методическое руководство содержит теоретические и практические основы к проведению электрофизиологических экспериментов регистрации ионных токов и потенциалов с одиночных клеток мозга.
Руководство предназначено для студентов 4 курса дневного отделения, обучающихся по направлению подготовки "Биология", по профилю "Биофизика" в рамках проведения практических работ по курсу "Нейрональные сети".
Ответственный за выпуск:
председатель методической комиссии биологического факультета ННГУ,
д.п.н., профессор И.М. Швец
УДК 612:57.087 (075.8)
ББК Е 707+Ес (я 73)
© Нижегородский государственный
университет им. Н.И. Лобачевского, 2012
© Дембицкая Ю.В., Лебедева А.В.,
Тюрикова О. В., Семьянов А.В., 2012Введение
Методика электрофизиологической регистрации активности клеток «Патч-кламп», впервые была использована в 1976 году Неером и Сакманом, с тех пор эта методика постоянно совершенствуется и увеличивается число вариантов использования, что позволяет решать широкий спектр экспериментальных задач. Данный метод позволяет регистрировать изменения потенциала и токов на мембране клетки, с различных типов клеток, в т.ч. с одиночных каналов. Через контакт между кончиком стеклянного микроэлектрода и мембраной клетки, имеющим высокое сопротивление. Такое высокое сопротивление позволяет получать записи с небольшим уровнем шумом. Достаточным, даже для регистрации токов с одиночных каналов, и применяется для изучения их проводимости и кинетики. Термин «patch-clamp» означает изолированный участок, возникающий за счет контакта стеклянного микроэлектрода и участка клеточной мембраны, на котором и осуществляются исследования ионных токов и изменение потенциала. Со времен появления метода, был разработан широкий спектр модификаций данного метода. Усовершенствована система регистрации и обработки сигналов.
-
Методика Патч-кламп
Принцип метода заключается в электрической изоляции участка мембраны и внеклеточного раствора и регистрации протекающих через него токов. Для этого применяется стеклянный микроэлектрод (рис.1), заполняемый электролитом, между которым образуется плотный контакт с мембраной клетки (10 МОм и выше). Это необходимо по двум причинам: во-первых, для наиболее полной электрической изоляции, а во-вторых, для снижения уровня шума записи, и при этом флуктуации шума ( ) тока протекающего через резистор (R), будут определяться по формуле (1):
 (1)
где, k-константа Больцмана, Т – абсолютная температура (°К),  - пропускная способность (Гц).
Б
А
В
Рисунок 1. Стеклянные микроэлектроды (увеличение в 400 раз). А) диаметр кончика – 1-2 µм. Б) Диаметр кончика – 3,5 µм. В) Диаметр кончика – 1-1,5 µм
-
Электрическая эквивалентная схема для метода патч-кламп
Мембрану клетки можно представить как конденсатор, с наличием изолирующего и проводящего компонентов. В качестве изолятора выступает липидный бислой, а в качестве проводников ионные белковые каналы, встроенные в этот бислой, сквозь которые протекает ионный ток. На рисунках 2 и 3 показаны эквивалентные электрические схемы регистрирующей установки, по которой регистрируемый ток будет зависеть от величины соотношения (2):
 (2)
Где Rseal– сопротивление контакта, а Rpipette– сопротивление микроэлектрода.
Основные необходимые компоненты установки для регистрации патч-клампом:
А. Усилитель. Б. Стимулятор. В. Персональный компьютер (для регистрации сигналов).
 
А
Б
Рисунок 2. А) Контакт между пипеткой и клеткой. Сопротивление контакта и микроэлектрода определяется между усилителем и электродом сравнения. Б) Электрическая эквивалентная схема при регистрации методом патч-кламп
Наиболее важной частью являются усилитель и наличие в нем преобразователя ток/потенциал (рис.3).
Рисунок 3. Схема преобразователя ток/потенциал
Ток протекает через электрод (Ipip), затем через резистор с высоким сопротивлением (R), что приводит к падению напряжения, пропорционально измеренному току на пипетке. Усилитель (I/Vусилитель) используется для автоматической регулировки источника напряжения для поддержания постоянного потенциала между пипеткой (Vpip) и электродом сравнения (Vref). Поскольку ответ усилителя является достаточно быстрым, можно считать, что Vpip=Vref. При протекании тока через мембрану, Vpip мгновенно меняется по отношению к Vref, тогда усилитель меняет командное напряжение Vs для создания Ipip, компенсирующего изменение Vpip. Таким образом, мембранный ток будет равным и противоположным по значению Ipip.Такой ток называется током фиксации в режиме (фиксированного потенциала)Voltage clamp. В режиме Current clamp (фиксации тока) используется понятие потенциала фиксации.
Кроме режимов фиксации тока и потенциала существует отдельная методика, называемая динамический кламп. Метод основан на фиксации проводимости мембраны клетки, для искусственного создания какой-то определенной проводимости. Для этого, измеряется мембранный потенциал клетки и определяется величина тока, которую нужно подать на клетку. Данная величина определяется в зависимости от потенциала реверсии для конкретной проводимости и создает движущую силу.
-
Разновидности конфигураций регистрации в режиме патч-клампа
Возникновение гигаомного контакта (gigaseal) является начальным и необходимым условием для всех конфигураций патч-клампа. Он возникает за счет сбрасывания первоначально небольшого позитивного давления (рис. 4А, Б) вблизи мембраны клетки, необходимого, чтобы кончик пипетки не засорялся, затем, за счет упругости мембраны, она схлопывается с отверстием микропипетки (рис. 4В), и образуется гигаомный контакт.
Г
В
Б
Рисунок4. Образование гигаомного контакта микроэлектрода с мембраной клетки. А) На микропипетку подается небольшое позитивное давление. Б) Приближаясь к мембране, возникает инвагинация. В) Сброс давления, при этом мембрана схлопывается с отверстием микропипетки, наблюдается быстрый рост сопротивления. Г) Сопротивление вырастает порядка ГОм, (возникновение гигаомного контакта)
А
Затем, существуют несколько возможных конфигураций патч-клампа (рис.5), в которых применяются различные типы растворов для заполнения микроэлектродов.
Whole-cell
Whole cell - это наиболее широко применяемая конфигурация патч-клампа. В данной конфигурации через пипетку регистрируется суммарный ток с целой клетки, и, за счет диффузии, внутриклеточное содержимое становится идентичным раствору, которым заполнена пипетка. В результате возникает искусственный ионный потенциал на мембране, и при этом клеточные структуры и регуляторные механизмы сохраняются относительно неповрежденными. В данном режиме применяется автоматическая или ручная компенсация емкости пипетки (Cp) на усилителе, поскольку она может влиять на величину последовательного сопротивления (Rs), характеризующую качество контакта между патч-пипеткой и клеткой.
Рисунок5.Схема конфигураций патч-клампа и применяемые для них растворы
Cell-attached
Эта конфигурация используется для регистрации токов с одиночных каналов, и для отделения токов необходимо предотвратить механические вибрации и скомпенсировать емкость пипетки. Активация каналов происходит при связывании с трансмиттерами или агонистами в составе раствора, заполняющего патч-пипетку. Открытие потенциал-зависимых каналов можно вызывать за счет изменения потенциала клетки. Состав раствора внутри пипетки идентичен раствору в камере микроскопа; замена раствора может использоваться для изучения свойств проницаемости каналов. Сопротивление контакта в данной конфигурации порядка гигаома и условия регистрации близки к физиологическим. Однако в данной конфигурации, невозможно достаточно точно измерить мембранный потенциал, поскольку содержимое клетки остается неизвестным, и внутриклеточную среду нельзя контролировать. Однако можно измерить, подавая тестовый импульс напряжения Vs порядка нескольких милливольт из уравнения (3):
 (3)
где,Vpatch – регистрируемое напряжение, Vmembr – потенциал покоя клетки
Или вычислить приближенное значение по соотношению Нернста (4):
 (4),
где, R- газовая постоянная, T–абсолютная температура, z- валентность иона, F- постоянная Фарадея, [ion]out, [ion]in–концентрация иона снаружи и внутри, соответственно.
Inside-out-patch
Эта конфигурация, в которой внутренняя часть мембраны оказывается повернутой наружу, а наружная - внутрь, и возникает она из конфигурацииcell-attached как показано на рисунке 5. Путем вытягивания участка мембраны в кончике пипетки, что можно сделать двумя путями, во-первых, быстро отведя пипетку от клетки, во-вторых плавно, при этом формируется закрытая везикула, которую затем переносят в ванночку с внутриклеточным раствором, при переносе через воздух внешняя мембрана разрушается. В таком случае разность потенциалов на мембране будет равна разности потенциалов на электроде, и растворы по обе стороны мембраны можно четко контролировать.
Outside-out-patch
Эта конфигурация возникает из конфигурации whole-cell, если медленно отводить патч-пипетку, при этом у мембрана начнет вытягиваться в трубку и постепенно замкнется на пипетку в вывернутом виде. Этот метод так же подходит для изучения одиночных каналов. Однако эта конфигурация имеет недостаток в виде довольно высокого уровня шума, поскольку снижается сопротивление контакта.
-
Приготовление стеклянных микроэлектродов
Выбор материала зависит от свойств клетки, и основное различие заключается в термических свойствах. Необходимо учитывать способность материала образовывать пипетки с определенной формой и размерами конуса, уровнем шума, который необходимо компенсировать за счет обратной связи, наличие в составе ионов металлов. Например, ионы тяжелых металлов снижают температуру плавления, но выход этих ионов раствор может изменить свойства изучаемых ионных каналов, и соответственно, свойства мембраны. Поскольку эти ионы могут быть источниками загрязнений, в растворах используют ЭГТА и ЭДТА, хелаторы тяжелых металлов, обладающие высокой аффинностью.
Микропипетки выполненные из легкоплавких материалов, имеют широкий конус и отверстие, и часто используются для подачи веществ (например агонистов) непосредственно в ткань.
Для патч-клампа нейронов используется стеклянные боросиликатные электроды толщиной 1,5мм, приготовленные с помощью специального прибора - пуллера, и имеющие сопротивление 5-9 МОм. Выбор данного материала связан с тем, что ранее было показано, что микроэлектроды с содержанием натрия или калия, способны усиливать проводимость калиевых каналов. Кроме того, боросиликатные микроэлектроды, имея высокую температуру плавления, обеспечивают оптимальное соотношение величины кончика и сопротивления.
Приготовление микроэлектродов с помощью пуллера требует регулировки таких параметров:
Уровень нагрева филамента электрическим током для плавления стекла, который зависит от филамента и используемого материала и диаметра стеклянной трубки.
Сила вытягивания. Чем она больше, нем меньше диаметр кончика и тем длиннее конус.
Скорость вытягивания, которая определяет момент, когда прекращается нагрев, чем она меньше, тем медленнее будут двигаться крепления стеклянной трубки.
Время охлаждения
Задержку охлаждения, позволяющую охладить сильнее стекло перед следующим нагревом, за счет чего увеличивается диаметр кончика пипетки, без увеличения его длинны.
Для записи активности одиночных каналов используют материалы, обеспечивающие низкий уровень шума. Обычно это кварцевые микроэлектроды. Но для изготовления таких микроэлектродов необходим очень сильный нагрев, для чего используется пламя горения кислорода или пуллеры с лазерным нагревом.
-
Заполнение микроэлектрода раствором
Для получения контакта между стеклянным микроэлектродом и клеткой, необходимо его заполнить проводящим раствором, посредством которого осуществляется контакт с хлорсеребряной проволокой. Нужно хлорировать часть серебряной проволоки электрода, которая контактирует с раствором. Остальная часть остается не захлорированной, для контакта с усилителем. Микроэлектрод заполняется раствором до самого кончика, чтобы в нем не оставалось пузырьков воздуха. Применяются два типа растворов в зависимости от выполняемой конфигурации «патч-кламп». Для конфигураций «inside-out» и «cell-attached» используется внеклеточный раствор (или раствор Рингера), для «whole cell»и «outside-out» используется специальный внутриклеточный раствор.
После помещения среза в камеру микроскопа, необходимо выбрать клетку для записи. От того насколько хорошо выбрана клетка, зависит качество записи. Во-первых, клетка должна находиться строго в выбранном поле. Если выбирается пирамидный нейрон поля СА1 гиппокампа, то лучше выбирать клетки в центральной части СА1 области, и не смещаться значительно в сторону СА2 или субикулума (в данной области слой расширяется и клетки лежат менее плотно) (рис. 6А), поскольку электрофизиологические свойства этих клеток могут отличаться. Во-вторых, клетка не должна располагаться очень близко к поверхности, поскольку, у таких клеток, возможно повреждение ответвляющихся отростков (рис. 6Б). Клетки, располагающиеся более глубоко, лучше сохраняют отростки и, соответственно, синаптические контакты. Однако для более глубоко расположенных клеток имеются оптические ограничения по уровню контраста и видимости. В-третьих, выбранная клетка должна иметь характерную форму, вытянутую (если это СА1 пирамидный нейрон), располагаться в слое, быть гладкой, а цитоплазма однородной. На такой клетке легче увидеть инвагинацию мембраны под давлением, и получить устойчивый контакт с электродом (рис. 6В).
А
|
