ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ СИСТЕМЫ КРОВИ
Ц е л ь з а н я т и й. Изучить нарушения, возникающие в животном организме при изменении количества крови, количественного и качественного состава ее форменных элементов, гемопоэза.
Задание 1. Изучить последствия изменений общей массы крови у животных.
О п ы т 1. Гиповолемия у кролика.
М а т е р и а л ь н о е о с н а щ е н и е: клетки для кроликов (4); кюветы (4); изогнутые ножницы (2); инъекционные иглы (2); стеклянные капилляры (26); микроцентрифуги (2); 70%-ный раствор этилового спирта (6 мл); эфир (6 мл); гепарин (5000 ЕД в 1 мл) (1,5 мл); подопытные животные: кролики (4).
П о с т а н о в к а о п ы т а. Для проведения занятия с подгруппой студентов берут двух однополых кроликов массой более 2,5 кг. Одного из них за трое суток до опыта лишают воды и сочных кормов, содержат только на сухих кормах (сено, овес, комбикорма).
В часы занятий обоих кроликов помещают в деревянные решетчатые клетки. Выстригают шерсть над краевой веной уха. Кожу обезжиривают спиртом и эфиром. У одного, а затем у второго кролика инъекционной иглой прокалывают кожу и венозный сосуд. Выступающую каплю крови снимают ватой, последующую порцию крови используют для заполнения стеклянного капилляра. Стеклянные капилляры, предназначенные для определения величины гематокрита, перед употреблением должны быть вымыты, обезжирены, внутренние стенки обработаны гепарином, высушены.
Гематокритную величину определяют по одной из следующих методик.
1.Пипетку Панченкова предварительно промывают гепарином, высушивают, набирают в нее кровь до 100 мм, закрывают резиновым кольцом. Кольцо сначала слегка натягивают на кончик пипетки, а потом закрывают ее верхний конец. После этого пипетку помещают в гнездо центрифуги и центрифугируют в течение 10 мин при 5000-6000 мин (в -1 степени). При центрифугировании вследствие разной удельной массы форменных элементов и плазмы в нижней части капиллярной трубки оседают эритроциты, в верхней – плазма соломенно-желтого цвета. Этот метод прост и удобен в практической работе.
2.Для определения величины гематокрита используют ручную микроцентрифугу Шкляра.
В гнезда насадки вкладывают градуированные микропипетки, заполненные кровью. Для предупреждения ее просачивания в гнезда насадки вмонтированы резиновые прокладки. Насадку укрепляют на оси центрифуги. Вращают рукоятку в течение 7-9 мин со скоростью 60-70 мин (в -1 степени) (насадка с капиллярами вращается со скоростью не менее чем 7000 мин в -1 степени). После центрифугирования отсчитывают деления с центрифугированными форменными элементами крови и определяют величину гематокрита.
3.Используют электрическую микроцентрифугу Шкляра (рис. 29) в соответствии с инструкцией. При работе с центрифугой запрещено следующее: работать без заземления корпуса прибора, пользоваться центрифугой с открытой крышкой, включать сразу большую скорость, открывать крышку до полной остановки электродвигателя.
4.Применяют эритровольтметр.
Расчет гематокритной величины проводят по формуле:
высота столба эритроцитов
----------------------------------- · 100 гематокрит, %
высота всего столба крови
У кроликов она колеблется от 35 до 45.
Согласно международной системе единиц (СИ) величина гематокрита выражается в литрах (объем эритроцитов) на 1 л крови (у кролика 0,35-0,45 л/л).
Одним из перечисленных способов определяют и сопоставляют величины гематокрита у интактного, контрольного кроликов и кролика, которому в течение трех дней не давали воды.
О ф о р м л е н и е п р о т о к о л а о п ы т а. Записывают схему опыта и использованную методику определения гематокритной величины. Отмечают результаты исследования. Делают выводы о влиянии водного голодания на показатель гематокрита.
О п ы т 2. Влияние гиперволемии на кровообращение в сосудах языка лягушки.
М а т е р и а л ь н о е о с н а щ е н и е: препаровальные дощечки (15); булавки (105); кюветы (15); микроскопы стереоскопические (6); микроскопы обычные (9); шприцы на 5 мл с иглой (15); глазные пипетки (15); раствор Рингера для холоднокровных (100 мл); 10%-ный раствор этилового спирта (300 мл); подопытные животные: лягушки (15).
П о с т а н о в к а о п ы т а. Лягушку наркотизируют алкоголем, помещают на препаровальную дощечку брюшком вверх. Булавками фиксируют верхнюю челюсть у края круглого отверстия и все четыре лапки. Иссекают кожу и грудную кость над областью сердца для лучшего доступа к сердечной мышце. Из ротовой полости осторожно извлекают язык, расправляют его над отверстием. Препарат кладут на предметный столик стереоскопического или обычного микроскопа. Изучают стереоскопическую и микроскопическую картину кровоснабжения ткани языка. В полость желудочка вводят 5-6 мл раствора Рингера и наблюдают за характером кровотока. Обращают внимание на скорость движения крови, число функционирующих сосудов, количество форменных элементов в осевом слое тока крови. Сопоставляют с исходным кровотоком.
О ф о р м л е н и е п р о т о к о л а о п ы т а. Записывают ход эксперимента. Отмечают изменения кровотока, возникшие после существенного увеличения объема циркулирующей крови.
О п ы т 3. Влияние гетерогенной гемотрансфузии на организм кролика.
М а т е р и а л ь н о е о с н а щ е н и е: клетки для кролика (2); кюветы (2); шприцы на 5 мл с иглой (2); электрокардиографы (2); предметные стекла (2); стеклянные палочки (2); изогнутые ножницы (2); кровь коровы (8 мл); 5%-ный лимоннокислый натрий (2 мл); 70%-ный раствор этилового спирта (10 мл); подопытные животные: кролики (2).
П о с т а н о в к а о п ы т а. Кролика массой тела 1,8-2,5 кг помещают в деревянную клетку, ограничивающую движения. Над краевой веной уха выстригают шерсть, кожу протирают спиртом, сосуд прокалывают и набирают в пробирку 3-5 мл крови. После ее свертывания каплю сыворотки наносят на поверхность чистого предметного стекла, в которую добавляют небольшой объем гетерогенной крови, предназначенной для переливания. Сыворотку с кровью смешивают легкими касаниями стеклянной палочки. Спустя 3-5 мин обнаруживают склеивание эритроцитов, их агглютинацию.
На конечности животного накладывают электроды. Регистрируют исходную электрокардиограмму в трех стандартных отведениях. Визуально подсчитывают число дыхательных движений в 1 мин. После этого в краевую вену уха медленно вводят 3 мл гетерогенной крови, стабилизированной лимоннокислым натрием. Во время трансфузии, а также спустя 5-10-15 мин ведут запись электрокардиограммы и подсчитывают число дыхательных движений. Обращают внимание на общее состояние животного.
О ф о р м л е н и е п р о т о к о л а о п ы т а. Записывают определение несовместимости крови. В тетрадь вклеивают электрокардиограммы, которые затем обрабатывают. Обобщают весь материал, полученный в ходе опыта. Делают вывод о влиянии гетеротрансфузии на организм реципиента.
Задание 2. В опытах на животных изучить изменения количественного и качественного состава эритроцитов.
О п ы т 1. Моделирование и изучение гемолитической анемии у кроликов.
М а т е р и а л ь н о е о с н а щ е н и е: клетки для кроликов (4); кюветы (4); шприцы на 5 мл с иглой (2); смесители для красной крови (15); микроскопы (15); камеры Горяева (15); электрофотоколориметры (2); стандартный набор для определения гемоглобина гемоглобинцианидным методом; гемометры Сали (15); аппараты Панченкова для определения СОЭ (2); вата (50 г); фильтровальная бумага (30 г); 5%-ный раствор фенилгидразина (20 мл); 70%-ный раствор этилового спирта (20 мл); 1%-ный раствор натрия хлорида (70 мл); 0,1 н. раствор хлористоводородной кислоты (5 мл); 5%-ный раствор лимоннокислого натрия (5 мл); подопытные животные: кролики (4).
П о с т а н о в к а о п ы т а. На кролика массой тела более 2 кг действуют гемолитическим ядом – фенилгидразином, вызывающим тяжелую форму анемии. За четыре дня до занятий кролику в краевую вену уха в течение трех дней подряд вводят 1%-ный раствор фенилгидразина из расчета 1 мл на 1 кг массы тела. В день занятий измеряют ряд показателей красной крови у подопытного и контрольного кроликов.
Пробы периферической крови берут из сосудов уха, для чего выстригают шерсть, кожу протирают спиртом, после высыхания прокалывают краевую вену уха иглой, вытекающую кровь используют для анализов.
Определение числа эритроцитов. В абсолютно чистый и высушенный смеситель для красной крови набирают кровь до метки 0,5. Манипуляцию взятия проводят быстро. При этом следят, чтобы не попали пузырьки воздуха. После взятия крови кончик капилляра быстро вытирают ваткой или фильтровальной бумагой, погружают в сосуд с 1%-ным раствором натрия хлорида и набирают до метки 101. Смеситель закрывают с обоих концов большим и средним пальцами рук и осторожно встряхивают содержимое в течение 1-2 мин для получения равномерной взвеси эритроцитов. Получают разведение крови в 200 раз. Подсчет форменных элементов красной крови осуществляют в камере Горяева (рис. 30), которую предварительно покрывают шлифованным стеклом, притертым до появления радужных кругов (ньютоновых колец). Из меланжера (смесителя) удаляют на ватку три первые капли содержимого, а затем одну капельку взвеси эритроцитов подводят под среднюю пластинку камеры, куда жидкость поступает в силу капиллярности. Между покровным стеклом и пластинкой не должно быть пузырьков воздуха.
Поверхность сетки разделена на большие и малые квадраты. Часть больших разделена на 16 малых квадратов, площадь каждого составляет 1/400 мм², высота всех камер равна 1/10 мм. Таким образом, объем малого квадрата 1/4000 мм³. Подсчет клеток проводят под малым увеличением микроскопа в пяти больших квадратах, начиная с левого маленького квадрата. Считают эритроциты, расположенные в каждом маленьком квадрате, и те, которые касаются левой и верхней стенок. Эритроциты, касающиеся правой и нижней стенок, не учитывают.
Для определения числа эритроцитов в 1 мкл крови (Х) используют формулу
А·4000·b
Х = -------------- ,
В
где А – число эритроцитов в пяти больших квадратах; b – степень разведения крови (1:200); В – количество маленьких квадратов в пяти больших (80); 4000 – 1/4000 объема счетной камеры над маленьким квадратом, мкл.
Для определения числа эритроцитов в 1 л крови (Х) используют формулу Х=А·10 (в десятой степени). Получают величину Т/л, где Т – тера, равна 10 в двенадцатой степени.
Определение количества гемоглобина. Наиболее точен гемоглобинцианидный колориметрический метод. Для анализа берут опытную, стандартную и контрольную пробы. Для подготовки опытной пробы к 5 мл трансформирующего раствора добавляют 20 мкл (0,02 мл) испытуемой крови, тщательно перемешивают и оставляют стоять в течение 10 мин. Затем колориметрируют при зеленом светофильтре (длина волны 500-560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольной пробы, в качестве которой берут трансформирующий раствор. Стандартная проба – это стандартный раствор гемоглобинцианида, ее исследуют в том же порядке, что и опытную пробу.
Количество гемоглобина (Нb, г на 100 мл) определяют по формуле
ЕопСК·0,001
Нb = ------------------ ,
Ест
где Еоп – оптическая плотность опытной пробы; Ест – оптическая плотность стандартной пробы; С – концентрация гемоглобинцианида в стандартном растворе (59,75 мг на 10 мл); 0,001 – коэффициент для пересчета мг в 1 г; К – коэффициент разведения крови (251).
Для установления количества гемоглобина в 1 л крови полученную цифру нужно умножить на 10.
Для определения количества гемоглобина в крови можно использовать метод Сали. Он менее точен, чем предыдущий, но прост в исполнении и широко распространен. Гемометр Сали (рис. 31) состоит из трех пробирок одного диаметра, помещенных в штатив, задняя стенка которого выполнена из стекла молочного цвета. Средняя пробирка пустая, она отградуирована и предназначена для исследуемой крови. Обе боковые пробирки запаяны и наполнены стандартным эталонным раствором, содержащим 167 г/л гемоглобина. К гемометру приложены капиллярная пипетка емкостью 20 мм³, пипетка для воды, стеклянная палочка для размешивания.
Принцип определения заключается в том, что под действием разведенной хлористоводородной (соляной) кислоты гемоглобин превращается в солянокислый гематин. Полученный раствор гематина разбавляют в градуированной (средней) пробирке дистиллированной водой до тех пор, пока его цвет не совпадет с цветом стандартных растворов. Количество гемоглобина устанавливают по уровню жидкости в градуированной пробирке в соответствии с имеющейся шкалой.
Для выполнения исследования в градуированную пробирку приливают 0,1 н. раствор хлористоводородной кислоты до метки 0. Из свежей капли крови кролика капиллярной пипеткой набирают 20 мкл. Оттуда кровь (без потерь) приливают к хлористоводородной кислоте в градуированной пробирке, тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Полученную гемолизированную кровь оставляют стоять в штативе гемометра на 5-10 мин до образования прозрачной бурой жидкости – соляно-кислого гематина. Дистиллированную воду капают до тех пор, пока цвет жидкости не сравняется с цветом стандартных растворов гемометра Сали. При этих условиях количество гемоглобина будет одинаковым в стандарте и в исследуемой крови. Отсчет ведут по нижнему мениску жидкости в градуированной пробирке, шкала которой показывает абсолютное содержание (г/100 мл) гемоглобина в исследуемой крови. Далее рассчитывают содержание гемоглобина в ммоль/л. Используют формулу
В·0,6206,
где В – количество гемоглобина (г/100 мл, г%), 0,6206 – коэффициент пересчета. Например, В=9 г%, тогда 9·0,6206=5,6 ммоль/л (по системе СИ).
Вычисление цветового показателя (ЦП). Для определения степени насыщенности эритроцитов гемоглобином используют формулу
Нb2Е1
ЦП = ----------- ,
Нb1Е2
где Hb1 – среднее количество гемоглобина в норме (г/л); Hb2 – количество гемоглобина у исследуемого животного (г/л); Е1 – среднее число эритроцитов в норме (1·10 в 12 степени/л); Е2 – среднее число эритроцитов у исследуемого животного (1·10 в 12 степени/л).
Вычисление среднего содержания гемоглобина в одном эритроците. Для определения этой величины используют данные о содержании эритроцитов и количестве гемоглобина в 1 мкл (1 л) крови. Для вычисления содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ), выраженного в пг (1 пг = 1 · 10 в -12 степени г), применяют формулу
Hb
СГЭ = ------- ,
Эр
где Hb – количество гемоглобина в 1 мкл (1 л) крови, пг; Эр – число эритроцитов в 1 мкл (1 л) крови.
Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) по методу Панченкова. Вычисляют скорость разделения цельной крови на плазму светло-желтой окраски и форменные элементы красной окраски за счет гемоглобина эритроцитов. Для определения берут градуированный стеклянный капилляр (от 0 до 100 мл), промывают его 5%-ным раствором лимоннокислого натрия. Набирают раствор до метки Р (высота 50 мм) и выпускают на часовое стекло. Из капли крови, взятой от кролика, в тот же капилляр дважды набирают кровь, до метки К и приливают ее к раствору лимоннокислого натрия в часовое стекло, тщательно перемешивая жидкости. Затем капилляр наполняют цитратной кровью и укрепляют в штативе в строго вертикальном положении (рис. 32). Результат оседания эритроцитов отмечают через час. Выражают СОЭ в мм/ч.
Таким образом, у контрольного и интактного кроликов определяют содержание в крови числа эритроцитов, количество гемоглобина, цветовой показатель, среднее содержание гемоглобина в одном эритроците, СОЭ. Используя полученные данные, составляют общую картину изменений красной крови при гемолитической анемии.
О ф о р м л е н и е п р о т о к о л а о п ы т а. Кратко описывают принципы определения показателей красной крови, использованные в эксперименте. Выполняют расчеты по рекомендованным формулам, фиксируют в протоколе. Полученные данные вносят в таблицу. Объясняют механизм изменений картины крови при гемолитической анемии.
О п ы т 2. Морфология эритроцитов у здоровых поросят и поросят-гипотрофиков.
М а т е р и а л ь н о е о с н а щ е н и е: микроскопы (15); термостаты (2); шлифованные стекла (30); предметные стекла (30); ножницы (2); пробирки (12); краска Романовского-Гимзы (100 мл); метиловый спирт (60 мл); гепарин (5000 ЕД в 1 мл) (1 мл); кедровое масло (10 мл); подопытные животные: здоровые поросята (6), поросята-гипотрофики (6).
П о с т а н о в к а о п ы т а. В день занятий берут кровь от шести здоровых поросят (5-недельного возраста) и шести поросят-гипотрофиков того же возраста, стабилизируют ее гепарином и используют для получения мазков с целью изучения морфологии эритроцитов. При этом учитывают, что поросята-гипотрофики с низким уровнем физиологической зрелости всегда страдают апластической анемией.
Из доставленных проб крови студенты изготавливают мазки. Для этого стеклянной палочкой каплю крови наносят на предметное стекло, отступив на 1-1,5 см от его узкого края. Пальцами левой руки удерживают стекло за длинные ребра. В правую руку берут шлифованное стекло, подводят его к капле и ждут, когда кровь равномерно распределится по шлифу. Затем быстрым движением шлифованного стекла справа налево покрывают предметное стекло тонким равномерным слоем крови (рис. 33). Для получения хорошего мазка предметное стекло должно быть достаточно обезжирено, слегка подогрето, шлиф должен равномерно касаться его поверхности, масса крови должна быть равномерно распределена, без перерывов и пустот. Полученный мазок высушивают на воздухе или в термостате (37ºС). Высушенный препарат погружают на 3-5 мин в метиловый спирт, окрашивают по Романовскому и вновь сушат.
Окрашенный мазок помещают под микроскоп для анализа элементов красной крови. Во время микроскопирования мазков обращают внимание на следующие изменения.
I.Наличие дегенеративных форм эритроцитов:
1)анизоцитоз характеризуется разной величиной элементов красной крови – наличием макро- и микроцитов;
2)пойкилоцитоз – изменения формы эритроцитов (звездчатые, овальные, грушевидные, серповидные);
3)анизохромия – появление слабоокрашенных (гипохромных) и сильноокрашенных (гиперхромных) эритроцитов;
4)эритроциты с кольцами Кебота;
5)эритроциты с тельцами Жолли.
II.Изменения количества клеток физиологической регенерации:
1)увеличение полихроматофильных эритроцитов (полихромазия – множественность цветовой окраски);
2)увеличение числа ретикулоцитов (специальная суправитальная окраска);
3)появление нормобластов (нормобластоз).
III.Наличие клеток патологической регенерации:
1)мегалобласты оксифильные;
2)мегалобласты полихроматофильные;
3)мегалоциты.
Результаты, полученные при анализе крови, взятой от разных животных (здоровых и гипотрофиков) несколькими студентами, обобщают и обсуждают.
О ф о р м л е н и е п р о т о к о л а о п ы т а. Кратко описывают способ получения и окраски мазка крови. Зарисовывают найденные патологические формы эритроцитов. Сопоставляют морфологическую картину элементов красной крови у здоровых поросят и поросят-гипотрофиков.
О п ы т 3. Моделирование гемолитической анемии паразитарного происхождения у крыс
М а т е р и а л ь н о е о с н а щ е н и е: операционные столики для крыс (2); хирургические наборы (2); большие стеклянные воронки (2); микроскопы (15); камеры Горяева (15); смесители для красной крови (15); гемометры Сали (15); микроцентрифуги электрические (2); аппараты Панченкова (2); эфир для наркоза (30 мл); 70%-ный раствор этилового спирта (30 мл); 1%-ный раствор натрия хлорида (70 мл); 0,1н. раствор хлористоводородной кислоты (15 мл); 5%-ный раствор лимоннокислого натрия (15 мл); подопытные животные: крысы (4).
П о с т а н о в к а о п ы т а. За 7-10 дней до занятий студенты вместе с преподавателем проводят операцию по удалению селезенки у белой крысы. Для этого животное под эфирным наркозом фиксируют на столике брюшком вверх. Операцию проводят в стерильных условиях. Готовят операционное поле и по белой линии живота послойно рассекают брюшную стенку. Длина разреза не более 2 см. Через операционное отверстие проникают в брюшную полость, находят селезенку и осторожно извлекают ее, пользуясь анатомическим пинцетом. Перевязывают разволокненной шелковой нитью нервно-сосудистый пучок у основания органа, затем иссекают селезенку. На операционную рану послойно накладывают швы. Спленэктомированная крыса заболевает бартонеллезом. Бартонеллы внедряются в эритроциты, разрушают их. У животного на 7-10-й день после операции развивается гемолитическая анемия.
В день занятий для обследования берут здоровое животное (контрольное) и подопытное с гемолитической анемией. Кровь для гематологического анализа получают из кончика хвоста. Часть студентов подгруппы определяет содержание эритроцитов в крови, другие устанавливают количество гемоглобина, гематокритную величину, скорость оседания эритроцитов, цветовой показатель. Для изучения морфологических изменений элементов красной крови приготавливают мазки.
О ф о р м л е н и е п р о т о к о л а о п ы т а. Записывают условия проведения эксперимента и результаты собственных исследований. Объясняют патогенез гемолитической анемии паразитарного происхождения.
О п ы т 4. Состояние гемостаза у кроликов при мегалобластной анемии.
М а т е р и а л ь н о е о с н а щ е н и е: микроскопы (15); предметные стекла (15); покровные шлифованные стекла (15); стеклянные палочки (15); шприцы на 1 мл (2); пробирки (селиконированные или парафинированные) (4); лейкоцитарные смесители (15); камеры Горяева (15); чашки Петри (15); секундомеры (2); капиллярные трубки (15); пробирки (15); фильтровальная бумага (20); 1%-ный раствор оксалата аммония (10 мл); 14%-ный раствор сернокислой магнезии (10 мл); 0,1%-ный раствор акридина оранжевого (2мл); метиловый спирт (40 мл); 0,9%-ный раствор натрия хлорида (1,2 л); краска Майя-Грюнвальда (30 мл); краска Романовского (30 мл); дистиллированная вода (1,5 мл); 1%-ный раствор трилона Б (1 мл).
П о с т а н о в к а о п ы т а. Для изучения гемостаза берут двух взрослых однополых кроликов. Одному из них за пять дней до занятий ежедневно в ушную вену вводят раствор сапонина в возрастающей дозе, начиная с 1 мг и заканчивая 5 мг на 1 кг массы тела животного, растворяя его в 1 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида.
Кровь для исследований берут у интактного кролика и у кролика с экспериментальной мегалобластической анемией из сосудов уха. Изучают физико-химические свойства крови, используя различные тесты.
Существует более 20 способов подсчета кровяных пластинок, которые сводятся к определению их числа в окрашенном мазке в счетной камере и фазово-контрастной микроскопией.
Метод Фонио. Основан на предотвращении склеивания тромбоцитов добавлением к крови раствора сернокислой магнезии и подсчете их в окрашенном мазке.
Для выполнения анализа волосы на ухе кролика на участке против краевой вены тщательно выстригают, кожу протирают спиртом и эфиром. На обезжиренную сухую кожу наносят 1-2 капли 14%-ного раствора сернокислой магнезии. Для появления крови делают укол иглой через нанесенную жидкость. Обе жидкости перемешивают парафинированной палочкой и делают тонкий мазок на хорошо обезжиренном предметном стекле. Мазки высушивают на воздухе, окрашивают по Паппенгейму, для чего на нефиксированный мазок наносят неразведенный (фабричный) краситель Майя-Грюнвальда (2 мл), представляющий собой раствор эозина и метиленового синего в метиловом спирте. Спустя 3 мин к краске прибавляют 2 мл дистиллированной воды, смешивая их стеклянной палочкой или тонкой пипеткой. Через 1 мин, когда мазок приобретет розовый оттенок, краску сливают и, не высушивая, в течение 10-15 мин красят рабочим раствором краски Романовского, затем промывают дистиллированной водой и высушивают. Мазок изучают под иммерсионной системой микроскопа с помощью окуляра со счетным окошечком по Фонио. В каждом поле зрения считают сначала все эритроциты, а затем все тромбоциты. Передвигают препарат, меняя участки мазка до тех пор, пока не будет подсчитано 1000 эритроцитов и соответствующее количество кровяных пластинок. Исходя из общего числа эритроцитов в 1 л крови, с помощью составления пропорции рассчитывают количество тромбоцитов в том же объеме.
Подсчет тромбоцитов под люминесцентным микроскопом. Этим методом получают более четкие результаты. Согласно методике М.П.Яковлевой мазок, полученный по Фонио, после фиксации метиловым спиртом обрабатывают 3-4 мин раствором акридина оранжевого в разведении 1:1000 в изотоническом растворе натрия хлорида. Препарат покрывают покровным стеклом, избыток краски удаляют фильтровальной бумагой. Края покровного стекла заливают жидким парафином для предотвращения высыхания. В поле зрения подсчитывают число эритроцитов и тромбоцитов по методу Фонио.
В тромбоцитах различают периферическую беззернистую часть – гиаломер и внутреннюю – грануломер, который содержит азурофильную зернистость. Существуют четыре разновидности кровяных пластинок: юные тромбоциты, зрелые формы, старые и регенеративные формы. Последние не встречаются в обычных, физиологических, условиях. К ним относят гигантские пластинки, пластинки с большими отростками, очень мелкие пластинки, тромбоциты с очень крупной или пылевидной зернистостью. У здоровых кроликов число тромбоцитов составляет 125-250 Г/л (125-250·10 в девятой степени/л).
Определение тромбоцитов в счетной камере по методу Хауке. В шприц на 1 мл набирают 0,5 мл 1%-ного раствора трилона Б и 0,5 мл крови и быстро переносят в селиконированную (парафинированную) пробирку, где ее можно хранить в течение нескольких часов до анализа. Для подсчета набирают кровь из пробирки в лейкоцитарный меланжер (смеситель) до метки I, затем набирают 1%-ный раствор оксалата аммония до метки II. Жидкости смешивают и меланжер оставляют на 20 мин для гемолиза эритроцитов. После этого хорошо перемешивают содержимое смесителя в течение 2-3 мин, первые капли выпускают и заряжают счетную камеру. Так как тромбоциты оседают медленно, камеру ставят на 10 мин в чашку Петри с мокрой ваткой на дне. После этого подсчитывают тромбоциты в пяти больших (80 маленьких) квадратах. Для вычисления количества кровяных пластинок (Х) в 1 л пользуются формулой
Х = А · 10 в девятой степени,
где А – количество тромбоцитов, подсчитанное в пяти больших квадратах.
Определение времени кровотечения. Подготавливают участок уха кролика в его средней трети: тщательно выстригают волос, кожу обрабатывают сначала спиртом, потом эфиром, высушивают. Целостность кожи капилляров и вену на ограниченном участке нарушают стерильным копьем длиной 4 мм. С момента появления крови включают секундомер. Самопроизвольно выделяющуюся кровь снимают полосками фильтровальной бумаги через каждые 15-20 с, не прикасаясь ею к раневому отверстию. Секундомер останавливают тогда, когда окончательно прекращается вытекание крови. По времени, прошедшему от начала до окончания выхода крови, определяют время кровотечения. На этот показатель большое внимание количество тромбоцитов в крови и их качественная полноценность. Время кровотечения у здоровых кроликов составляет 2-4 мин.
Определение времени свертывания крови. Используют наиболее простой капиллярный метод по Шульцу. Капиллярную трубку диаметром 1 мм, длиной 15 см или специальный капилляр Шульца (рис. 34) подносят к выступающей капле и наполняют кровью. Кровь поднимается самотеком в силу капиллярности. Заполненный капилляр располагают таким образом, чтобы один конец был несколько выше другого. По секундомеру отмечают время начала анализа, т. е. момент заполнения капилляра кровью.
Через каждые последующие 30 с обрезают кусок капиллярной трубки длиной 1 см или отрезают одну бусинку капилляра Шульца и с помощью пинцета погружают в пробирку с изотоническим раствором натрия хлорида. При встряхивании пробирки первые пробы несвернувшейся крови смешиваются с жидкостью, окрашивая ее в красный цвет. Начало свертывания характеризуется более слабой окраской раствора, на дне пробирки обнаруживают свертки крови. О полном свертывании крови в капилляре свидетельствует отсутствие окраски изотонического раствора. Свернувшаяся кровь не вытекает из капиллярной трубки. Отмечают время конца свертывания.
Кроме состояния самой крови на скорость ее свертывания влияют также температура окружающей среды, количество крови, способы ее получения и определения, другие моменты. Поэтому в протоколе опыта необходимо очень точно указать условия эксперимента. У нормальных кроликов время свертывания крови составляет от 3 до 4,5 мин.
Определение относительной плотности крови и плазмы. Готовят серию растворов сульфата меди плотностью от 1,016 до 1,075. Для анализа используют как свежеполученную кровь, так и стабилизированную гепарином или трилоном Б. В пробирку с рабочим раствором глазной пипеткой с высоты 1 см опускают одну каплю крови или плазмы, которая погружается на глубину 2-3 см. Если относительная плотность капли больше плотности раствора – она тонет, если меньше – всплывает. Когда же относительная плотность крови или плазмы равна удельной плотности раствора, то капля остается во взвешенном состоянии, положение ее не меняется. Может быть и такое явление, когда в одном растворе капля всплывает, а в другом тонет, тогда относительную плотность устанавливают по среднему между ними показателю. Например, если при опускании капли крови в раствор с относительной плотностью 1,048 она всплывает, а в растворе с относительной плотностью 1,046 опускается на дно, то относительная плотность ее равна 1,047 кг/л.
|
