1. назначение

Скачать 325.72 Kb.

Название	1. назначение
страница	4/5
Тип	Документы

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Документы

1 2 3 4 5

7б. Пробоподготовка Универсальная

Пробоподготовка Универсальная рекомендуется использовать при вы-

делении чистой ДНК из биологических жидкостей и тканей, богатых ДНК

(крови, гомогената ткани, клеточной суспензии, соскоба слизистой и т.д.).

7б.1. Приготовление рабочего раствора Солевого буфера. Содержимое флако-

на с Солевым буфером, 10 мл, перенести в мерный цилиндр, довести биди

стиллированной водой до метки 100 мл, затем 96% этанолом до метки 300 мл и

перемешать. Полученный раствор следует хранить в герметично закрытой

посуде при температуре 2-8 ⁰С в течение одного года.

7б.2. В 1,5 мл пробирку добавить 100 мкл. пробы (кровь, плазма, сыворотка, со-

скоб слизистой в физрастворе, моча и др.), добавить 300 мкл Лизирующего

реагента и перемешать, переворачивая пробирку.

10. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА

10.1. В пробе из пробирки маркированной (+) должна быть видна специфическая полоса ДНК определенного размера (табл. 2) и соотвествующая внутреннему контролю вторая полоса размером 108 пн (Универсальный внутренний контроль, УВК, используется при необходимости).

10.2. В пробирке маркированной (-) специфическая полоса ДНК определенного размера должна отсутствовать, а полоса внутреннего контроля размером 108 пн должна быть видна (в случае использования УВК).

10.3. В пробирке маркированной для анализируемых проб наличие полосы строго на уровне полосы положительного контрольного образца свидетельствует о положительной реакции образца на возбудитель. Полоса внутреннего контроля размером 108 пн также должна быть видна (при использовании УВК).

10.4. Результаты анализа должны быть отменены:

а) в случае наличия полосы в отрицательном контрольном образце на уровне полосы положительного контроля (результат контаминации),

б) при отсутствии полосы внутреннего контроля размером 108 пн в в анализируемых пробах и контролях (свидетельство наличия ингибирования PCR или же потерь ДНК при пробоподготовке).

10.5. Наличие слабых полос выше или ниже полосы положительного контрольного образца может быть результатом неспецифической амплификации, которые не должны быть приняты во внимание.

11. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА.

11.1. Все компоненты наборов реагентов GenePak^™ DNA PCR test можно транспортировать при темп. окружающей среды, от минус 20 до 30 ⁰С.

11.1. Все компоненты наборов реагентов следует хранить при температуре от 2-8 ⁰С в течение 1 года со дня выпуска.

11.2. Готовый рабочий раствор протеолитического комплекса ЭнзиМикс^™ следует хранить при минус 20 ⁰С в течение 1 года со дня разведения.

11.3. Готовый рабочий раствор Солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при 2-8 ⁰С 1 год со дня разведения.

11.4. Готовый рабочий раствор TBE буфера для электрофореза можно хранить при температуре 21-23 ⁰С в течение двух месяцев.

11.5. Для получения воспроизводимых результатов необходимо строгое соблюдение объемов добавляемых PCR Растворителя и исследуемой ДНК.

9.2. Приготовление агарозного геля. В коническую колбу на 500 мл внести содержимое флакона с агарозой, добавить 200 мл готового ТВЕ буфера и поместить колбу на электрическую ппитку. Довести содержимое колбы до кипения и после того, как агароза полностью расплавится, колбу с агарозой снять с плитки. Готовая агароза должна быть прозрачной и не должна содержать нерасплавленных частиц.

* Примечание: Для быстрого приготовления агарозы можно исполь-

зовать микроволновую печь (2 мин при “высокой мощности”).

9.3. Подготовка электрофоретической камеры к заливке агарозного геля. Установить крышку с ванночкой на камеру, а платформу для заливки геля поместить в ванночку. Установить гребенку на платформу.

9.4. Расплавленную агарозу охладить приблизительно до 50 ⁰С в теплой воде или на столе при комнатной температуре. Затем в колбу с готовой агарозой внести 15 мкл этидиума бромида и осторожно перемешать содержимое колбы равномерными вращательными движениями.

9.5. Агарозу налить на платформу. Толщина слоя агарозы должна быть около 4 мм.

9.6. После застывания агарозы (примерно через 20-25 мин) осторожно, чтобы не порвать карманы, вынуть гребенку, а платформу с застывшим агарозным гелем перенести из ванночки в электрофоретическую камеру.

9.7. Добавить ТВЕ буфер в электрофоретическую камеру так, чтобы буфер покрывал агарозный гель слоем приблизительно 2-3 мм.

9.8. Отобрать 10 мкл продукта амплификации из-под Масла и добавить в соответствующую лунку агарозного геля, осторожно, чтобы предотвратить перетекание из одного кармана в другой.

9.9. Установить крышку на камеру, подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и установить на источнике питания напряжение 100-200 В (не более 15 В/см).

9.10. Через 20 - 30 мин (примерно 0,5 см прогона синей краски) электрофоре-

тическую камеру отключить от источника питания, отсоединить провода

от камеры, снять крышку с электрофоретической камеры.

9.11. Вынуть платформу с агарозным гелем из электрофоретической камe-

ры, дать жидкости стечь с геля и осторожно промыть агарозный гель водой.

Внимание! При работе с арагозным гелем и бромистым этидием

следует обязательно надевать резиновые перчатки!

9.12. Осторожно перенести гель на экран УФ трансиллюминатора.

9.13. Надеть защитную маску или установить защитный экран, включить трансиллюминатор и проанализировать полученные результаты

7б.3. Термостатировать пробирку при 65 ⁰С 5 мин. При наличии несолюбилизи-

рованного осадка в пробирке центрифугировать 5-10 с при 5000 об/мин,

супернатант перенести в чистую пробирку, а осадок отбросить.

7б.4. Добавить в пробирку 20 мкл суспензии сорбента NucleoS^™ (перед использованием NucleoS^™ следует интенсивно встряхнуть на вортексе до полного гомогенного состояния).

7б.5. Перемешать пробирку на ротаторе или вручную 5 мин, центрифугировать

10 с при 5000 об/мин и удалить супернатант с помощью водоструйного или аналогичного насоса. Если выделение ДНК проводится из цельной крови или гомогенатов тканей с высоким содержанием гемоглобина, осадок сорбента после центрифугирования и удаления супернатанта следует промыть еще 200 мкл Лизирующего реагента. Далее по протоколу.

7б.6. Добавить в пробирку 1,0 мл Солевого буфера (см. положение 7б.1) и

интенсивно перемешать.

7б.7. Центрифугировать 10 с при 5000 об/мин.

7б.8. Удалить осторожно супернатант, не задевая осадок, с помощью насоса.

7б.9. К осадку добавить 1,0 мл Солевого буфера, тщательно перемешать на вортексе 5-10 с до полного гомогенного состояния.

 Примечание: Если суспендирование затруднено из-за сильного слипания

сорбента, то его необходимо вначале механически разбить

осторожным перемешиванием наконечником пипетки, а за-

тем интенсивно перемешать на вортексе.

7б.10. Центрифугировать пробирку 10 с при 10000 об/мин.

7б.11. Удалить супернатант, не задевая осадок, с помощью насоса.

7б.12. Посушить осадок при 65 ⁰С 3-5 мин.

7б.13. Добавить в пробирку 100 мкл исходного ЭкстраГена^™ .

Внимание! ЭкстраГен^™ следует отбирать от общего объема при

постоянном перемешивании.

7б.14. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5-10 с до гомогенного состояния, после чего термостатировать 5 мин при 65 ⁰С. Еще раз суспендировать содержимое пробирки на вортексе перед центрифугированием.

7б.15. Центрифугировать пробирку 1 мин при максимальных оборотах

(10000 об/мин).

7б.16. Перенести чистый супернатант с ДНК (без гранул ЭкстраГена^™ и

NucleoS^™ ) в пробирку для хранения или сразу использовать для

постановки PCR. При попадание гранул ЭкстраГена^™ в реакционную про-

бирку происходит ингибирование реакции, что приводит к появлению

ложноотрицательных результатов. Хранить при температуре минус 20 ⁰С.

1 2 3 4 5

Похожие:

	Где отображены вопросы: Назначение цеха и выпускаемая продукция Назначение, устройство, кинематика и принцип действия гильотинных ножниц с нижним резом		Тема Стрелковое оружие и ручные противотанковые гранатометы Занятие 1 Назначение и боевые свойства ак-74,рпк-74, общее устройство, принцип работы. Назначение частей и механизмов
	Инструкция по установке и эксплуатации назначение Назначение. Электромеханический шлагбаум spin 3, 4, 6 предназначен для ограничения въезда и выезда с охраняемых территорий (автостоянки,...		1. Назначение, устройство, принцип работы Назначение Коленчатый вал воспринимает усилия, передаваемые от поршней шатунами, и преобразует их в крутящий момент, который затем через маховик...
	1. 1 Служебное назначение и технические характеристики детали Для составления качественного технологического процесса изготовления детали необходимо тщательным образом изучить ее конструкцию...		Паспорт Назначение Назначение: Ограничитель грузоподъемности с регистратором параметров кпб-3 (далее огпиР) предназначен для ограничения грузоподъемности...
	Назначение PowerShell 2 Установка Windows PowesShell 6 Назначение PowerShell 7		Коммерческое предложение Сверлильно-присадочный alfa 21 Classic (1... Назначение: Сверлильно-присадочные станки предназначены для сверления сквозных и глухих отверстий в торцах и плоскостях мебельных...
	Техническое задание №170 2017 на проектирование и поставку автоматизированной... Назначение оборудования: Перемещение комплектующих по территории цеха от склада до рабочего места. Осуществляется с помощью автоматизированного...		Тематическое планирование учебной программы по технологии 10 класс Хозяйстве. Основные сборочные единицы колесного и гусеничного тракторов, их назначение, расположение и взаимодействие. Понятие о...
	7. Назначение каждого компонента 5 Информация индикаторов 5 Операция... Это руководство описывает правильное использование скутера, азы вождения. Для правильного и безопасного вождения, пожалуйста тщательно...		7. Назначение каждого компонента 6 Приборная панель и индикаторы... Переключатель / Ближний и дальний свет / Переключатель поворотов / Звуковой сигнал открытого
	Пояснительная записка к тестовой работе по биологии в 10 классе для... Назначение работы: определить степень сформированности знаний, основных умений и навыков, оценить качество подготовки учащихся по...		Добавление информации об оплате за жку в поле «Назначение платежа» Если получатель является поставщиком жку, введите информацию об оплате за жку в поле Назначение платежа с помощью специального окна...
	Инструкция по подаче заявления в электронном виде по услуге " Назначение... Назначение и выплата областного единовременного пособия при рождении ребенка через портал		Методика определения нервно-психической устойчивости и риска дезадаптации... Назначение и содержание. Методика разработана в Санкт-Петербургской военно-медицинской академии и предназначена для выявления нервно-психической...

Руководство, инструкция по применению