Выбор метода молекулярно-биологического типирования генов системы hla крови доноров и реципиентов при аллогенных трансплантациях гемопоэтических стволовых клеток
|
Скачать 103.63 Kb.
|
|
Волкова О.Я. Выбор метода молекулярно-биологического типирования генов системы HLA крови доноров и реципиентов при аллогенных трансплантациях гемопоэтических стволовых клеток. Типирование генов системы HLA, основанное на анализе ДНК, довольно широко применяется при трансплантации органов и тканей, так как имеет целый ряд преимуществ по сравнению с серологическими и цитологическими методами [6]. Это, прежде всего, высокая чувствительность и специфичность, небольшой объем проб для исследования, возможность долгосрочного хранения образцов и выделенной ДНК, довольно быстрое выполнение полного тестирования. Кроме этого, молекулярно-биологические методы тестирования позволили открыть большое количество новых генов и аллелей, которые просто невозможно выявить серологическими и цитологическими методами. Все используемые в настоящее время методы анализа ДНК очень широко используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР), которая позволяет амплифицировать нужные фрагменты генов. Наиболее распространенными являются следующие молекулярно-биологические методы HLA-типирования: ПЦР с использованием сиквенс-специфических праймеров (Sequens-Specific Primers (SSP), сиквенс-специфических олигонуклеотидных проб (Sequens-Specific Oligonucleotide (SSOP) и типирование методом сиквенирования (Sequens Based Typing (SBT) [3]. В методе ПЦР-SSP используются многочисленные пары праймеров, которые позволяют определить практически все изученные алели специфических локусов системы HLA. Этот метод дает хорошие результаты и удобен для лабораторий с небольшим объемом исследований, так как требует достаточно больших временных затрат для прочтения результатов после электрофореза в агарозном геле [4,6]. В этом случае в качестве дополнительного метода, когда комбинация праймеров не позволяет разделить аллели, используют метод ПЦР-SBT. Для лабораторий с большим объемом исследований наиболее распространенным является метод ПЦР-SSOP. Спецификой этого метода является сравнительно небольшое (8-10 по сравнению с 96 в ПЦР-SSP) количество амплификационных пробирок с локус-специфическими праймерами. Получившийся ампликон подвергают гибридизации, продукт которой визуализируется фермент-зависимым колориметрическим методом. Этот метод получил название дот-блот (dot blot). Для ускорения процедуры и уменьшения количества пробирок широко используют метод обратного дот-блота, в котором амлифицированную ДНК исследуемого образца помещают на мембрану или в пробирку с последующим добавлением индивидуальных олигонуклеотидных проб. В настоящее время методы ПЦР-типирования стали одними из самых распространенных для выявления генов HLA II класса. Но высокая чувствительность и специфичность делает их все более широко применяемыми и для типирования генов I касса. Технология ПЦР сделала возможным изучение фрагментов генов и за короткое время стала наиболее важным молекулярно-биологическим методом HLA-типирования. Так как полиморфизм генов HLA затрагивает лишь некоторые экзоны, ПЦР – методы сфокусированы только на небольшом фрагменте HLA-гена. Это преимущественно экзон 2 для II класса и экзоны 2 и 3 для I класса HLA-генов. Диагностика полиморфизма системы HLA молекулярно-биологическими методами потребовала принятия некоторых общих правил относительно полиморфной структуры HLA генов. Разнообразие HLA генов на антиген-презентирующих сайтах развивается с одной стороны благодаря постепенному накоплению точечных мутаций как наследуемых признаков, а с другой стороны благодаря конверсии и рекомбинации генов [2]. Последний механизм является, по-видимому, определяющим фактором огромного разнообразия HLA-генов и их полиморфной структуры. Когда подробно изучили последовательности различных аллелей в локусе, стало понятно, что аллельное многообразие характеризуется не аллель-специфическими точечными мутациями, а различными комбинациями последовательных фрагментов в общем пуле различных фрагментов. Такая фрагментарная структура аллельных последовательностей объяснила происхождение полиморфизма как изменений в отдельных последовательностях нуклеотидов. Таким образом, большинство аллелей могут считаться химерами, образованными различными частями других аллелей. В большинстве случаев вновь идентифицируемые аллели характеризуются как новые комбинации уже существующих последовательных фрагментов. Из этого можно заключить, что число аллелей в каждом локусе представляет собой число теоретически возможных комбинаций последовательных фрагментов. Такие особенности полиморфной структуры HLA гена определяют основные направления стратегии HLA-типирования. Более 90% индивидуумов являются гетерозиготными во всех локусах системы HLA. Таким образом, для HLA-типирования на аллельном уровне не достаточно доказать наличие определенных последовательных фрагментов, а необходимо определить их цис/транс положение, то есть продемонстрировать как фрагменты связаны в каждом из двух гаплотипов [5]. Именно такой подход способен дать недвусмысленные результаты типирования. Если цис/транс положение разных сайтов не определено, множественные гетерозиготные аллельные комбинации нельзя отличить друг от друга. Кроме этого, новые аллели могут быть ошибочно типированы как гетерозиготная комбинация известных аллелей. Методики ПЦР, которые включают амплификацию обоих аллелей, присутствующих в части HLA-локуса называется локус-специфической ПЦР. Полученный в результате ПЦР продукт содержит генные фрагменты обоих аллелей, в идеале в более или менее равных количествах. На практике, однако, в зависимости от условий ПЦР, количества амплификационных праймеров и анализируемого локуса, обычно существует преимущество в амплификации одного аллеля перед другим. Преимущественная амплификация может вызвать проблемы, если полученные ПЦР-фрагменты используются для прямого сиквенирования. Методики, которые приводят к амплификации ограниченного числа родственных аллелей, называются группоспецифической ПЦР. Группоспецифическая ПЦР использует преимущественно близкие последовательные гомологи определенных кластерных аллелей. Эти последовательные гомологи обычно отражают тот факт, что группоспецифически амплифицированные аллели являются соответствующими серологическим группам. Таким образом, термин «группоспецифический» в норме обозначает ПЦР-амплификацию, которая по специфичности родственна серологической вариабельности локуса, то есть специфична для всех аллелей, имеющих серологический фенотип HLA-A1 или HLA-A2. По крайне мере один из праймеров, используемых в группоспецифической ПЦР находится в последовательном фрагменте, который присутствует только в ограниченном количестве аллелей. Группоспецифическая амплификационная стратегия является одним из наиболее важных подходов к определению цис/транс положения последовательных фрагментов. Если метод, используемый для ПЦР-амплификации, позволяет амплифицировать аллели HLA-локуса в соответствии с серологической вариабельностью, то аллели всех серологически гетерозиготных индивидуумов могут быть амплифицированы раздельно. Такой вариант амплификации часто называют аллель- или гаплотип-специфической ПЦР. Однако, термин «аллель-специфический» традиционно применяют для ПЦР амплификаций, которые позволяют выделить аллель, присутствующий или отсутствующий на ПЦР фрагменте. Группоспецифическая ПЦР амплификация не во всех случаях гаплотип-специфическая. У тех индивидуумов, кто гетерозиготен по различным аллелям, относящимся к одной амплификационной группе, ПЦР приводит к амплификации обоих аллелей одновременно, как и в локус-специфической ПЦР. Однако, благодаря закрытым последовательным гомологам, количественное соотношение между амплифицированными фрагментами различных аллелей обычно более гомогенно, чем в локус-специфической ПЦР, что облегчает специфическое определение после ПЦР. Замечено, что такие тесно связанные аллели иногда отличаются в единственном нуклеотиде, который позволяет определить цис/транс положение без гаплотип-специфической ПЦР. Таким образом, основным принципом современного молекулярно-биологического анализа для HLA-типирования является гаплотип-специфическая ПЦР-амплификация полиморфных экзонов HLA-генов, с последующим послеамплификационным специфическим определением гипервариабельных регионов для идентификации аллелей. В процессе развития ПЦР-методов для HLA-типирования было описано большое количество различных методов, которые в основном различаются в стратегии послеамплификационного определения индивидуальных последовательностей амплифицированных фрагментов. Методики, применяемые для анализа амплифицированных фрагментов, включали оценку полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polimorfism (RFLP), полиморфизма структуры одиночных цепей (Single-Strand Conformation Polimorfism (SSCP), гетеродуплексных структур (Heteroduplex Formation (HDF), сиквенс-специфических олигонуклеотидных проб (Sequens-Specific Oligonucleotide Probing (SSOP), сиквенс-специфических праймеров (Sequens-Specific Primers (SSP), и определение нуклеотидных последовательностей ПЦР-амплифицированной ДНК методом сиквенирования (Sequens Based Typing (SBT). На 11 Международном совещании по вопросам гистосовместимости метод ПЦР-SSOP был признан стандартизованным методом для определения генов II класса системы HLA во всех лабораториях. Рутинное использование методов на основе ПЦР во многих лабораториях во всем мире позволило проникнуть глубоко внутрь полиморфизма HLA-генов, которые оказались намного более вариабельными, чем ожидалось исходя из данных, полученных общепринятыми до этого методами типирования. Такое разнообразие сильно усложнило применение методов типирования на основе ПЦР, поэтому в течение последних лет только три метода (ПЦР-SSOP, ПЦР-SSP, ПЦР-SBT) в основном используются для HLA-типирования на уровне нуклеотидов. Сиквенирование дает наиболее надежную и достоверную информацию о ДНК-последовательности в генах и что особенно интересно, для полного определения и понимания комплексности HLA-полиморфизма. В противоположность другим ПЦР-методам, сиквенирование не ограничивается выявлением только известного полиморфизма последовательностей в гипервариабельных регионах, также как методы конформационного анализа (ПЦР-SSCP, ПЦР-HDF). Однако ПЦР для этих методов довольно сложна и никогда не обеспечивает 100% чувствительности и не показывает природу вариабельности, как это делает сиквенирование. Более того, в зависимости от вариантов методики, сиквенирование способно также выявить цис/транс положение последовательных фрагментов. Сиквенирование для HLA-типирования обычно не требует рассмотрения гена в целом, а ограничивается лишь той частью, которая показывает полиморфные сайты, такие как экзон 2 для II класса и экзоны 2 и 3 для I класса генов системы HLA. Поэтому метод сиквенирования для типируемых регионов после ПЦР был назван сиквенс-специфическим типированием (ПЦР-SBT). За последние годы ПЦР-SBT получило значительное развитие, что позволило рассматривать его как рутинный метод HLA-типирования. Хотя все предложения сиквенирования базируются на определениях дидиоксинуклеотидной цепи фермент-синтезированных ДНК-фрагментов, впервые предложенный Sanger с соавторами термин ПЦР-SBT [4] изначально описывал очень разнообразные методические подходы, что относилось к материалу, стратегии амплификации, пробоподготовке и сиксвенирующей химии. В настоящее время современное сиквенирование основывается на прямом сиквенировании ПЦР-продуктов из геномной ДНК с помощью методов с флюоресцентной меткой, использующих детерминированные красителем циклы сиквенирующей химии со специальными ДНК-полимеразами в автоматических капиллярных сиквенаторах [2]. Среди ПЦР- методов, ПЦР-SBT требует самого дорогостоящего оборудования. Это следствие того, что сиквенирование для клинических целей должно проводиться обязательно с помощью автоматического сиквенатора. Но сиквенирование имеет и очень важные преимущества перед другими методами типирования: 1) наиболее достоверные результаты типирования, так как это обеспечивается не только анализом нуклеотидных последовательностей, но и высочайшим потенциалом определения цис-положения последовательных фрагментов. 2) использование минимальных количеств исследуемого материала и небольшого по величине и количеству оборудования 3) огромные возможности автоматизации всех этапов исследования. Только сиквенирование, в отличие от других ПЦР-методов HLA-типирования способно выполнить полное типирование без необходимости применения каких-либо дополнительных методов [3]. Это позволяет провести типирование как низкого (2 знака), так и высокого разрешения (4 знака) в одном и том же высокопроизводительном формате, что делает сиквенирование очень привлекательным методом для малых, средних и больших лабораторий. ПЦР-амплификация полиморфных систем для прямого сиквенирования может быть ген- или гаплотип-специфической. Последний подход имеет два ощутимых преимущества. Во-первых, цис/транс положение последовательных фрагментов может быть определено, а во-вторых, можно избежать проблем, связанных с преимущественной амплификацией одного гаплотипа. Если используется только локус-специфическая ПЦР и оба аллеля амплифицируются одновременно, то один из аллелей амплифицируется часто более эффективно, чем другой. Эта проблема преимущественной амплификации ведет к тому, что один из аллелей «исчезает» при сиквенировании и наблюдается только один гаплотип, что в свою очередь приводит к ложному заключению о гомозиготности. Быстро возрастающее количество вновь идентифицированных аллелей подтверждает, что новые аллели появляются в основном благодаря генной конверсии, которая имеет место между различными аллелями в одном локусе. Вновь идентифицируемые аллели характеризуются в основном не новыми последовательными фрагментами, а скорее новыми комбинациями уже существующих последовательных фрагментов. Из этого можно заключить, что возможное количество аллелей в каждом локусе – это теоретическое число всех рекомбинаций последовательных фрагментов [2]. Это предполагает также, что число до сих пор неидентифицированных аллелей огромно. Если не учитывать цис/транс положения анализируемых полиморфных регионов, некоторые новые аллели могут быть ошибочно типированы как гетерозиготные комбинации известных аллелей. Это обуславливает SBT- стратегию: точные результаты типирования SBT после локус-специфической ПЦР-амплификации определяются лишь возможностями существующей в данный момент времени базы данных генов системы HLA. Однако, при появлении все большего числа новых аллелей, что является делом недалекого будущего, однозначные результаты, полученные сегодня, могут стать совсем не такими точными в будущем. С такими же тенденциями мы встречались в прошлом, например при ПЦР-типировании HLA-DRB1, или при ПЦР типировании HLA I класса [6]. Из вышесказанного следует, что точные результаты типирования могут быть получены только с учетом цис/транс положения последовательных фрагментов. Такая стратегия очень важна для типирования в клинических целях, так как результаты такого типирования будут оставаться точными, несмотря на все время расширяющуюся базу данных HLA [3]. Молекулярно-биологические методы исследования могут применяться везде, где необходимо типирование системы HLA. При этом в зависимости от цели типирования выбирается уровень его разрешения. Когда речь идет о HLA-типировании для трансплантации органов или трансфузий тромбоцитов, то достаточным является низкое разрешение (2 знака). А необходимость в самых точных методах типирования возникает в случае аллогенных трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток (4 знака) [1,3]. И, если раньше такое типирование выполнялось только для абсолютно необходимых локусов II класса и осуществлялось в основном методами ПЦР-SSOP или ПЦР-SSP, то в настоящее время совершенствование подходов лабораторной диагностики делает возможным рутинное осуществление типирования высокого разрешения и для I класса методом ПЦР-SBT. Список литературы:
|
Похожие:
 |
Е. Д. Дедков 11 апреля 2002г Методические указания предназначены для врачей и лаборантов спк и лечебно-профилактических учреждений, а также всех специалистов... |
 |
Методические указания n 2001/109 Методические указания предназначены для врачей и лаборантов спк и лечебно-профилактических учреждений, а также всех специалистов... |
|
Инструкция по заготовке и консервированию донорской крови (в ред... Заготовка крови от доноров осуществляется с учетом необходимости удовлетворения потребности лечебно-профилактических учреждений здравоохранения... |
|
Инструкция по криоконсервированию клеток крови введение для долгосрочного... Эти методы позволяют длительно (годами) сохранять клетки в жизнеспособном и функционально полноценном состоянии и после размораживания... |
|
Фетальные исследования в материалах Комитета по этическим и правовым... «мертвый плод», «трансплантация фетальных тканей», «получение стволовых клеток из эмбрионов» и т д. В россии распространено понятие... |
|
Московский государственный медико-стоматологический университет Заключает пособие глава, посвященная использованию стволовых клеток в иммунопатологии |
|
Высокодозная иммунносупрессивная терапия с аутологичной трансплантацией... |
|
Многокритериальный выбор оптимальной системы управления базы данных... Одной из главных проблем разработки приложения баз данных является выбор системы управления базами данных (далее субд). Выбранная... |
|
Предварительное решение Ходжкина, которые подвержены высокому риску развития рецидива после аутологичной трансплантации стволовых клеток (III фаза клинических... |
|
Цитотоксичность и генотоксичность антител к ДНК сывороток крови больных... Гбоу дпо «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации... |
|
Ежеквартальный отчет открытое акционерное общество «институт стволовых... Место нахождения эмитента: Российская Федерация, 129110, г. Москва, Олимпийский пр-кт, д. 18/1 |
|
Патологическая физиология системы крови цельзаняти й Ц е л ь з а н я т и й. Изучить нарушения, возникающие в животном организме при изменении количества крови, количественного и качественного... |
|
Программа «cell active» возраст-контроль на основе «стволовых клеток» Процедура «Нежный сон» с коллагеновой маской. Возраст-контроль процедура. Анти-стресс процедура. Уход за дегидратированной, атоничной... |
|
Программа «cell active» возраст-контроль на основе «стволовых клеток» Процедура «Нежный сон» с коллагеновой маской. Возраст-контроль процедура. Анти-стресс процедура. Уход за дегидратированной, атоничной... |
|
Исследование процесса растормаживания автомобиля с целью разработки... Аннотация: в статье изложены результаты анализа процесса растормаживания автомобиля. Исследованы зависимости интегрального показателя... |
|
Молекулярно- генетический профиль дофаминовой нейромедиаторной системы... Работа выполнена в фгбу «Национальный научный центр наркологии» Миндзрава России |