Биопрепараты на основе бактерий рода
|
Скачать 3.26 Mb.
|
СОЗДАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ БИОПРЕПАРАТОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ЗДОРОВЬЕ РАСТЕНИЙ 2.1. Общие принципы разработки биопрепаратов на основе бацилл Большинство биологических препаратов для защиты растений от фитофагов и фитопатогенов как в России, так и во всем мире производят на основе бактерий рода Bacillus. Биотехнология получения этих бактериальных препаратов достаточно проста. В производстве биопрепаратов основным является культивирование исходного штамма-продуцента на питательной среде (ПС) и получение необходимой препаративной формы. Выделим общие проблемы производства биопрепаратов. В первую очередь, для производства биопрепарата нужны активные исходные штаммы, а это требует селекции микроорганизмов. Селекцию ценных в отношении получения бактериальных препаратов бактерий осуществляют при выделении штаммов из природных источников, а также при получении экспериментальным путем (мутагенез, генная инженерия). Пока преимущественным направлением в селекции бактерий остается поиск и отбор активных природных штаммов из почвы, больных насекомых, зараженных тканей и органов растений. Критериями отбора являются: стабильная однородность популяции, высокая степень продуцирования спор и биологически активных веществ (БАВ), вирулентность и спектр патогенности для целевого объекта. Результатом такого отбора является штамм, превосходящий по качеству эталонные культуры продуцента препарата, необходимого для производства. Выделение бактерий в чистую культуру - необходимый этап после их извлечения из природных источников. В первую очередь для биотехнологии нужны активные исходные штаммы, а это требует селекции микроорганизмов. Критериями отбора новых штаммов являются: технологичность (однородность популяции, высокая степень продуцирования активного начала и т.д.), вирулентность и спектр действия. Если в течение многочисленных циклов культивирования свойства биологического агента не сохраняются или претерпевают существенные изменения, то данный биологический агент неприемлем и не может быть рекомендован для крупномасштабных технологических разработок. Результатом отбора должен быть штамм, превосходящий по качеству эталонные культуры существующего продуцента необходимого препарата. Важная роль принадлежит специализированным банкам биологических агентов (коллекции микроорганизмов). Коллекции культур обеспечивают сохранение жизнеспособности и генетических свойств штаммов. В России такие коллекции есть при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина (ВКМ), а также в некоторых других научных учреждениях. С селекцией связана проблема хранения штамма. Культуры микроорганизмов хранят на среде из свежезастывшего агара под вазелиновым маслом [Cираева и др., 2010] или без него; в лиофилизированном состоянии, в стерилизованной почве [Похиленко и др., 2009]. При хранении в пробирках на агаризованных питательных средах стабильность штамма обеспечивается при пересевах каждые 3-4 месяца. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента является главной задачей любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами. Из отселектированных штаммов готовят маточную культуру, из нее – посевную, предназначенную для посева в ферментеры. Посевную культуру выращивают глубинным способом в небольшом посевном ферментере или в колбах на качалках [Патент 2128915, 1999; Патент 2295562, 2007; Гришечкина, Ермолова, 2015]. При получении посевного материала принципиально важным является способ выведения пропагул хранящейся маточной культуры из анабиоза, состав среды и режим культивирования. Мониторинг процессов в главном ферментере проводят по нескольким параметрам: температуре, рН, количеству растворенного кислорода и другим [Сouch, 2000]. Выбирают оптимальные сроки культивирования, показатели рН и температуры для выращивания бактерий рода Bacillus [Асатурова, 2009; Гришечкина, Ермолова, 2015]. Следует отметить, что в ряде случаев технологичность перспективных штаммов связана с их фагоустойчивостью [Романовская и др., 2007]. Качество питательной среды – одно из важнейших условий получения высокоактивных препаратов. При конструировании питательной среды необходимо учитывать физиологические потребности микробной культуры в элементах азотистого, углеводного и минерального питания. Принимают в расчет протеолитическую способность культуры. Если активность микробных протеаз невысока, следует брать низкомолекулярные белки, а лучше расщепленные белковые соединения. Например, для экзотоксинсодержащего штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis (BtH 10) № 25, обладающего энтомоцидной и антифунгальной активностью, наилучшие показатели были получены на среде с гороховой мукой, заменяющей соевую. При росте на этой среде титр спор в культуральной жидкости 4х109/мл, активность экзотоксина (ЛК50) для тест-объекта составила 3,1 мкл/г корма, ингибирующая активность для Fusarium oxysporum 70,0 %, для B. cinerea 75,0 % [Патент 2514023, 2014]. Заключительным этапом производства биопрепаратов является получение приемлемой препаративной формы. Препаративная форма тесно связана с технологией применения биопрепаратов и со сроком их хранения. Проблема стабильности микробиологических препаратов актуальна, например, из-за необходимости накопления резервных запасов биопрепаратов. К концу приготовления препаративной формы должна сохраняться биологическая активность биологического продукта. Особенно это касается сухих форм, где часто требуется использование высокой температуры для высушивания биомассы. При использовании псевдоожиженных систем на входе температура колеблется от 180 до 215оС, на выходе 70-80оС [Couch, 2000]. Сухие формы представлены, как правило, смачивающимися порошками и диспергируемыми гранулами, а жидкие – водными концентрированными суспензиями и масляными эмульсиями [Штерншис и др., 2006]. В жидкие водные формы и смачивающиеся порошки вводят различные защитные ингредиенты. Предложена концепция защиты активности биопрепаратов при хранении [Штерншис, 1995]. Суть ее в том, что в процессе хранения происходит взаимодействие кислорода воздуха с компонентами поверхностных макромолекул. Взаимодействие биологических систем с кислородом наиболее полно описывается через механизм свободно радикального окисления макромолекул. Так, для бактериальных препаратов поверхность спор и кристаллов представляют белки и полисахариды. Поэтому механизм их взаимодействия с кислородом подчиняется основным законам свободно-радикального процесса, идущего через образование осколков молекул - свободных радикалов. Характерной чертой такого процесса является возможность управлять им с помощью инициаторов или ингибиторов свободных радикалов [Хекли, 1979]. Накопление свободных радикалов влияет на жизнедеятельность микроорганизмов. В связи с этим было показано, что снижение активности бактериальных препаратов объясняется образованием свободных радикалов. Этот процесс тормозится при введении антиоксидантов в малых концентрациях. В реальных условиях хранения препараты, смешанные с антиоксидантами, значительно меньше снижали свою активность, чем контрольные [Штерншис, 1995]. Защитный экранирующий эффект на микроорганизмы оказывают также активированный уголь, окись титана, яичный альбумин и т.д. В этих целях при получении бактериальных препаратов перспективно также микроинкапсулирование [Ma et al., 2015]. Инкапсулированные препараты очень устойчивы к облучению. Кроме того, значительно увеличивается удерживаемость препарата на поверхности растения за счет адгезионных свойств оболочки. Современные разработчики биопрепаратов учитывают необходимость оптимизации препаративной формы, что недооценивалось на первых этапах развития биотехнологии. Так, предложена иммобилизованная форма. Клетки, иммобилизованные на или в массе носителя, менее подвержены воздействию света, температурным колебаниям и другим абиотическим и биотическим факторам. Это обеспечивает более длительные сроки хранения биопрепаратов. Например, проведено исследование антифунгальной активности в процессе хранения биопрепарата на основе штамма B. subtilis BZR 336g, иммобилизованного на гранулированном минеральном удобрении с определением численности адсорбированных бактериальных клеток в процессе хранения [Асатурова, Козицын, 2015]. Авторы пришли к выводу, что лучшими условиями сохранения численности адсорбированных клеток на поверхности гранул минерального удобрения «ОМУ» при высушивании является способ перемешивания гранул при температуре +60⁰С в орбитальном шейкере. Особое внимание уделяется стандартизации готового продукта. Основные показатели стандартизации зависят как от активности исходного штамма, так и от препаративной формы биопестицидов [Kabaluk et al., 2010]. Стандартизация биопрепаратов проводится по числу спор, включений, метаболитов и по биологической активности. Последний показатель более значим. При этом надо иметь в виду, что биологическая активность биопрепаратов отличается от активности штаммов-продуцентов, поскольку в препаративные формы включены различные ингредиенты. Стандартизации подлежат все препараты на основе бактерий независимо от способов их производства. Количество жизнеспособных спор в 1г препарата определяют методом посева на питательные среды с подсчетом выросших колоний. Для посева используют разведение препарата, обеспечивающее рост не более 300 и не менее 50 колоний в одной чашке Петри. Разведение определяют делением предполагаемого титра на 300 и 50. Выросшие колонии подсчитывают при открытой чашке Петри и определяют титр препарата [Штерншис и др., 2006]. Титр препарата определяют по формуле:  , гдеN – среднеарифметическое число колоний из двух серий параллельных разведений; n – максимальное разведение. Общее количество спор или клеток можно подсчитать и более простым методом — в камере Горяева. Камера предназначена для подсчета количества клеток в заданном объёме жидкости. Она представляет собой предметное стекло с бороздами и нанесённой микроскопической сеткой. Размеры малых делений клетки сетки составляют 0,05 мм, а больших — 0,2 мм. При этом сетка нанесена на площадку (участок стекла), расположенный на 0,1 мм ниже, чем две соседние площадки. Эти площадки служат для притирания покровного стекла. Успешное притирание характеризуется появлением радужных колец (колец Ньютона). В результате объем жидкости над квадратом, образованным большими делениями сетки Горяева, составляет 0,004 микролитра. Подсчитав количество клеток над большим квадратом, определяют плотность спор в суспензии по формуле [Гулий и др., 1982]. Недостаток этого метода состоит в том, что подсчитывается общее количество спор, в том числе нежизнеспособных. В стандартизации и оценке качества биопрепарата главным показателем является его биологическая активность [McGuere et al., 1997]. Биологическая активность измеряется реакцией тест-объекта на действие биопестицида. Тест-объекты – возбудители болезней растений, насекомые либо клещи. Для более точной оценки биологической активности препаратов с целью сравнения используются стандарты, т.е. образцы микроорганизма- продуцента или биопрепарата, отвечающие всем необходимым условиям и требованиям. Существующие требования к стандартам: 1) идентичность механизма действия, 2) неизменность физико-химических свойств, 3) неизменность содержания БАВ, 4) неизменность биологической активности, 5) однородность состава, 6) срок хранения 5-10 лет при 5С, 7) стандарт изготавливается для одной или нескольких стран. Обычно производители препаратов используют внутренний стандарт, который должен периодически калиброваться с международным [Штерншис и др., 2006]. Для энтомопатогенных препаратов необходимыми требованиями к тест- объектам являются: 1) тест - объекты не должны быть карантинными вредителями; 2) должны легко разводиться в лабораториях и 3) регулярно восполняться при сборах в природе. Для биопрепаратов, предназначенных для подавления болезней растений, выбирают возбудителя болезни растений, легко выделяемого из природы, с одной стороны, и способного хорошо расти на ПС в лабораторных условиях, с другой стороны. При использовании стандартов биологическая активность испытуемого препарата (Е) подсчитывается делением ЛК 50 стандарта на ЛК 50 образца, где ЛК 50 - средняя концентрация суспензии, вызывающая гибель 50% целевых организмов. Стандартизация биопрепаратов включает дополнительно определение таких характеристик, как смачиваемость, стабильность рабочей суспензии, адгезионная способность и срок хранения. Для определения стабильности рабочей суспензии предложена методика, основанная на определении оптической плотности суспензии бактериального препарата при 400 нм. При этой длине волны величина оптической плотности пропорциональна концентрации препарата [Штерншис, 1985]. Стабильность суспензии вычислялась в процентах, исходя из измерений оптической плотности надосадочной жидкости через 30 мин и 4 часа после приготовления рабочей суспензии. Для определения адгезионной способности 1 мл 1%-й суспензии препарата распределяли на дно стеклянной чашки Петри, подсушивали, а затем заливали 1 мл стерильной воды. Через 2 часа отбирали пробы для оценки количества КОЕ в 1 мл. Вычисляли процент биологического агента, который удерживался на стекле. Для определения срока хранения образцы биопрепаратов помещают в боксы с разными температурными режимами. Как правило, образцы хранят при комнатной температуре, при +5º и -20º, хотя можно использовать и промежуточные интервалы. Ежемесячно в течение первого года, затем через 1,5, 2 и 3 года отбирают пробы и оценивают их титр и биологическую активность. Как правило, жидкие препаративные формы хранятся меньше [Штерншис, 1995; Сираева и др., 2010]. 2.2. Создание биопрепаратов для подавления болезней растений Бактерии рода Bacillus Cohn. широко используются в медицинской и ветеринарной биотехнологии в качестве продуцентов биологически активных веществ, ферментов, антибиотиков, а также, являясь пробиотическими микоорганизмами, входят в состав лекарственных средств и биологически активных добавок для человека и животных [Азизбекян, 2013]. Ранее применение бактерий рода Bacillus в биологической защите растений было ограничено, в основном, одним видом – B. thuringiensis, варианты которого послужили действующим началом применяемых в настоящее время эффективных биоинсектицидов. Однако многолетнее изучение свойств бактерий рода Bacillus позволило рассматривать их в качестве перспективных агентов биологического контроля болезней растений. Наиболее известным и часто включаемым в состав биофунгицидов является Bacillus subtilis. Бактерии B. subtilis относятся к грамположительным факультативно аэробным палочковидным бактериям. Клетки палочковидные, эндоспоры овальные, расположены центрально или парацентрально, не раздувают клетку при спорообразовании. Длина клетки - (2-3) мкм, ширина - (0,7-0,8) мкм. Капсулу не образуют. По Грамму окрашиваются положительно. Штаммы являются олигофильными, размножаются при 25 – 45°С, оптимальный рост наблюдается при температуре 33 – 37 °С. рН среды: минимальная 5,7; максимальная 8,0; оптимальная 7,0 - 7,2. Не растут в анаэробных условиях, не образуют ацетилметилкарбинол из глюкозы в реакции Фогес - Проскауэра, ферментируют с образованием кислоты глюкозу, маннозу, фруктозу, рибозу, ликсозу, целлобиозу, трегалозу, мальтозу, туранозу. Гидролизуют крахмал, мочевину и эскулин. Обладают лецитиназной, каталазной активностью. Толерантны к концентрациям хлорида натрия в питательной среде в диапазоне 1 – 9 % [Смирнов и др., 1982]. Бактерии B. subtilis являются продуцентами широкого спектра ферментов: протеаз [Холодная, 1999], липазы, амилазы [Патент РФ 2298032, 2007], ксиланазы [Патент РФ 2509149, 2014], эндонуклеазы (рестриктазы) [Патент РФ 2270859, 2006] и других [Широков, 2004]. Другие продукты, синтезируемые бактериями рода Bacillus, - биологически активные вещества различного состава и происхождения, коферменты, аминокислоты, полипептиды, бактериоцины оказывают антагонистическое влияние на патогенные микроорганизмы, в том числе на фитопатогены, и позволяют использовать данный вид бактерий в качестве основы для биофунгицидов. Поскольку факторы, определяющие будущую эффективность биопрепарата на основе бактерий Bacillus, весьма обширны и до сих пор до конца не изучены, наиболее распространенным способом поиска антагонистически активных штаммов является их выделение из объектов окружающей среды, чаще всего, природных экологических ниш: почвы, воды, растительных остатков, ризосферы растений, с последующим отбором перспективных вариантов по критерию антагонизма к фитопатогенам [Патент РФ 2289621, 2006; Патент РФ 2295562, 2007; Патент РФ 2314693, 2008; Патент РФ 2444366, 2012]. Выделенные в чистую культуру штаммы подвергают дальнейшему изучению [Нетрусов и др., 2005]. Основными критериями будущей пригодности их в качестве действующего начала биофунгицида являются: наличие антагонистической активности к широкому спектру фитопатогенов, технологичность промышленной наработки, способность расти на питательных средах различного состава, давая при этом максимальный выход биомассы, и стабильность свойств, при длительном хранении. Кроме того, штаммы, которые предполагается использовать в промышленной биотехнологии, не должны обладать токсическим воздействием на биологические объекты, в том числе культурные растения, членистоногих, теплокровных. Некоторые авторы практикуют более широкий подход к выбору штамма, который включает, помимо перечисленного выше, изучение ферментативной активности, симбиоза с почвенной микрофлорой, совместимость с наиболее применяемыми химическими пестицидами и агрохимикатами с целью возможности дальнейшего использования в баковых смесях с ними [Патент РФ 2478290, 2013]. Тем не менее, первым критерием оценки является спектр антагонистической активности выделенных изолятов, которую проверяют классическим методом отсроченного антагонизма [Егоров, 2004] либо методом агаровых блоков на средах Чапека, Гаузе, картофельно-глюкозном агаре [Билай, 1982]. Спорообразующие бактерии рода Bacillus обладают широчайшими возможностями в плане подавления возбудителей болезней растений. Так, авторы, занимавшиеся селекцией, отмечали наличие антагонизма к следующим фитопатогенным грибам: Alternaria alternata (Fr.) Keissl., A. solani Sorauer, A. brassicae (Berk.) Sacc., A. tenius Samuel Paul Wiltshire, Aspergillus niger van Tieghem, Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker , Botrytis cinerea Pers., Colletotrichum coccodes (Wallr.) S. Hughes, Cladosporium herbarum (Pers.) Link, Fusarium graminearum (Gibberella zeae(Schwein.) Petch), F. oxysporum Schlecht. emend. Snyder & Hansen, F. sambucinum Fuckel var. ossicolum (Berk. et Curt.), F. sporotrichioides Sherb., F. solani (Mart.) Appel et Wr., F. culmorum (Sm.) Sacc., F. avenaceum (Fr.) Sacc., Helminthosporium solani Durieu and Mont., Gliocladium roseum (Clonostachys rosea f. rosea (Link) Schroers, Microdochium nivale (Schaffnit) E. Müll., Oospora pustulans (Polyscytalum pustulans (M.N. Owen & Wakef.) M.B. Ellis, Phomopsis helianthi Munt.-Cvetk., Mihaljč. and M. Petrov, Phoma exigua var. solanicola Sacc., Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, Pythium sp. Pringsheim, Penicillium citrinum Thom C., P. expansum Link, Rhizoctonia solani J.G. Kühn, Verticillium dahliae Kleb., Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, и многим другим. Бактерии рода Bacillus являются основным объектом поиска новых антагонистов для подавления патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Вновь найденные штаммы часто сравнивают в отношении активности подавления фитопатогенных микроорганизмов с уже существующими и зарегистрированными. Так, авторы [Патент РФ 2295562, 2007] сравнивают активность найденного ими в ризосфере риса штамма Bacillus spp. KR-083 со штаммом B. subtilis ВНИИСХМ 128, являющимся действующим началом биопрепарата фитоспорин. В таблицах 2.1 и 2.2 представлены сравнительные результаты по антагонистической активности двух штаммов по отношению к фитопатогенным микроорганизмам (бактериям и грибам). Таблица 2.1. |
Похожие:
 |
Методическая разработка для студентов медицинских колледжей и училищ... Овладение знаниями и умениями по бактериологическому методу исследованию, освоение общих компетенций ок 1, ок 6, 7, 8, ок 12 |
|
Фамильная ветвь Фамилия имя рода или ветви рода. Рода имеют родоначальников в 10 12 веке, имена кланов (фамилии) как правило, пошли с тех давних... |
 |
Курсовая работа на тему: «Распространение микроорганизмов рода Clostridium... Получение ацетона и бутанола в ходе бактериального брожения представителей рода Сlostridium |
|
Форма выпуска Таблетки Состав Абактал синтетический противомикробный препарат из группы фторхинолонов. Оказывает бактерицидное действие, ингибируя репликацию ДНК... |
|
Морфологические свойства бактерий и методы их выявления Речкин А. И., Копылова Г. Е., Кравченко Г. А. Морфологические свойства бактерий и методы их выявления: Учебно-методическое пособие... |
|
Инструкция по применению питательного агара для выделения листерий палкам ... |
|
Инструкция по применению питательного агара для выделения листерий пал ... |
|
Благотворительность в зеркале сми Двери нашего центра открыты для всех. Практически все проводимые в центре мероприятия организованы на благотворительной основе. Благотворительность... |
|
Оао «Птицефабрика «Боровская» Документация Номер в плане закупок 51, 50 ... |
|
Обучающая программа по дисциплине Организация ЭВМ и систем содержание В авм для решения такого рода уравнений обычно используются электрические процессы, которые описываются (моделируются) такого же... |
|
Люси Истоки рода человеческого Перевод с английского канд биол наук... Восточной Африке, которые во многом изменили привычную картину происхождения и становления человеческого рода. Связанные с именами... |
|
Гуп рт «республиканский информационно-вычислительный центр» информационно-консультационный центр Биопрепараты комплексного действия повышают продуктивность и защищают растения от болезней |
|
На художественном абонементе представлена подборка книг «Ожидание... «Ожидание обезьян». Это своего рода литературное путешествие накануне нового года – Года обезьян. Цель подборки познакомить читателя... |
|
Рекомендации по эксплуатации и применению Воздействие на организм «мёртвой» воды Подавляет развитие болезнетворных бактерий, вирусов, возбудителей грибковых заболеваний |
|
Методические указания по выявлению бактерий Legionella Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г. Ф. Лазикова, Ю. М. Федоров) |
|
Прокофьев Евгений Сергеевич Содержание представителей рода Mycobacterium... Содержание представителей рода Mycobacterium в воде и обрастаниях аквариумов с замкнутой системой очистки воды |