Влияние бактериальных штаммов на поражение малины пурпуровой пятнистостью, 2008 г.
Вариант
|
Распространённость
болезни, %
|
Развитие
болезни, %
|
Биологическая
эффективность, %
|
Контроль
|
92,5
|
35,0
|
-
|
B. licneniformis
IC- 832-1
|
32,5
|
8,1
|
76,9
|
B. licneniformis
IC-831-1
|
32,0
|
10,8
|
69,1
|
B. subtilis
ВКПМ В -7092
|
42,5
|
10,6
|
69,7
|
Топаз
|
50
|
12,5
|
64,3
|
НСР05
|
|
7,0
|
|
Таблица 1.7
Влияние бактериальных штаммов на поражение малины пурпуровой пятнистостью, 2009 г.
Вариант
|
Распространённость
болезни, %
|
Развитие
болезни, %
|
Биологическая
эффективность, %
|
Контроль
|
75,0
|
25,0
|
-
|
B. licneniformis
IC- 832-1
|
43,2
|
10,8
|
56,8
|
B. licneniformis
IC-831-1
|
34,1
|
8,5
|
66,0
|
Bacillus subtilis
ВКПМ В -7092
|
38,6
|
9,7
|
61,2
|
Топаз
|
38,6
|
10,8
|
56,8
|
НСР05
|
|
4,0
|
|
В таблице 1.7. представлены результаты, полученные в 2009 г., отличавшемся по погодным условиям от предыдущего. В 2008 г. более активное проявление симптомов поражения пурпуровой пятнистостью могло быть связано с обильными осадками в июне, что обусловило проявление ранней инфекции – пурпуровой пятнистости. В 2009 г. в июне повышенное количество выпавших осадков способствовало проявлению симптомов заболевания, однако более активное проявление сдерживалось температурным фактором – в целом температурный режим в этот период был пониженным. В 2009 г. по сравнению с 2008 г. отмечались более частые и резкие перепады температуры и менее интенсивные осадки. Под влиянием биопрепаратов распространённость болезни уменьшилась в 1,7–2,7 раза по сравнению с контролем, а развитие заболевания в 2,2–2,9 раза по сравнению с контролем. Глубокого поражения побегов малины в этом году не было отмечено. Развитие болезни в контроле не превышало ЭПВ. Различия между вариантами с использованием биопрепаратов и химическим эталоном не существенны (d<�НСР05=4,0). Биологическая эффективность применения биопрепаратов была близка как для штамма B. subtilis, так для двух штаммов B. licheniformis, – от 54 до 66% Сравнение результатов по годам показало, что более всего влияние абиотических факторов отразилось на активности первого штамма, но не повлияло на эффективность двух остальных [Штерншис и др., 2010].
Кроме того, в полевых условиях нами изучена активность этих штаммов против септориоза черной смородины сорта Галинка, возбудитель Septoria rubis [Шпатова и др., 2011]. При испытании штаммов наиболее эффективными для защиты смородины черной от септориоза в течение вегетационных периодов 2008-2010 гг. оказались бактериальные штаммы B. licheniformis ВКПМ В-10561 и ВКПМ В-10562. Биологическая эффективность применения этих штаммов составляла в среднем за три года 74% (рис.1.2). Биологическая эффективность штамма B. subtilis ВКПМ В-10641 составила 60-69%, хотя в 2010 г. эффективность его применения (77%) превысила эффективность двух других штаммов, что можно объяснить аномальными условиями 2010 г. В первой половине вегетационного периода (май – июнь) в связи с низкими температурами до начала июня, холодными ночами в этот период проявление симптомов поражения грибными заболеваниями смородины отмечались единично. Более активное поражение септориозом наблюдали в июле и августе в связи с повышением температуры и более обильными осадками.
Рис. 1.2. Динамика пораженности черной смородины септориозом под влиянием обработок бактериальными штаммам и B. subtilis ВКПМ В-10641 и B. licheniformis ВКПМ В-10562, ВКПМ В-10561 (СХА «Сады Сибири») в среднем за 2008 - 2009 гг. (НСР05 по препаратам – 0,21; НСР05 по срокам – 0,17).
Биологическая эффективность химического эталона топаза в среднем за три года составила 85%, что объяснимо, так как данный препарат обладает более продолжительным периодом воздействия и менее подвержен влиянию погодных условий, чем экспериментальные препараты на основе бактериальных штаммов. Однако необходимо отметить, что в 2009 г. биологическая эффективность экспериментальных биопрепаратов достигла уровня химического фунгицида.
Проведенные исследования по снижению пораженности растений смородины септориозом показали, что результаты в целом сопоставимы с данными, полученными при обработке этими же препаратами растений малины против пурпуровой пятнистости [Штерншис и др., 2010].
Что касается биологического контроля других болезней плодовых и ягодных культур, то изучено влияние B. subtilis на серую гниль земляники [Hang et al., 2005; Helbig, Bochow, 2001] и яблок при хранении [Peighami-Ashnaei et al 2009], а также на болезни виноградников [Furuya et al., 2011]. Подавление возбудителя серой гнили B. cinerea на растениях винограда и плодов яблони продемонстрировано также при применении штаммов бактерии Bacillus spp., причем наибольшую активность проявлял вид B. licheniformis[Haidar, 2016; Touré, 2004].
Интродукция бацилл для биологического контроля болезней ягодных и плодовых культур вместо применения химических пестицидов особенно ценно в связи с преимущественным потреблением плодов этих растений в свежем виде, а также их использованием в лекарственных целях.
Представляет интерес возможность использования штаммов бацилл для подавления болезней картофеля – одной из основных продовольственных культур в России – как в период вегетации, так и в период хранения клубней картофеля. В этом плане в отношении возбудителя фузариоза картофеля показана возможность подавления роста фитопатогенов F. sambacinum, F. oxysporum и F. redolens. Среди активных штаммов были представители рода Bacillus: B. subtilis штаммы 1-3, B. weihenstephanensis и B. pumilis. Штаммы B. subtilis № 2 и 3 проявили наибольшую способность к ингибированию роста колоний микромицетов, в том числе против возбудителей сухой гнили картофеля [Марданова и др., 2015]. Продемонстрированы также возможности антагонистического эффекта B. licheniformis в отношении болезней картофеля [Sadfi et al., 2002].
Отмечено снижение поражения растений картофеля возбудителем ризоктониоза - фитопатогенным грибом R. solani при использовании бактериальных штаммов. Эффект подавления болезни варьировал от 12 до 83% [Schmiedeknecht et al., 1998; Donmez et a.l, 2015].
В отношении возбудителей черной ножки картофеля Erwinia carotovora var. Atroseptica и E. aroideae, а также сухой фузариозной гнили F. sambucinum изучена активность более 200 штаммов бактерий рода Bacillus [Дорожкин и др., 1991]. По данным И.И. Новиковой с соавторами [2013], антагонистический эффект исследованных ими штаммов бацилл против возбудителей ризоктониоза и серебристой парши варьировал в зависимости от биоагента и фитопатогена. Наиболее выраженное действие оказали B. subtilis И-5 12/23 и B. laterosporus Bl 101( до 78% в отношении возбудителя серебристой парши Helmintosporium soiani и до 42% в отношении возбудителя ризоктониоза картофеля Rhizoctonia solanii.
Подавление возбудителей ризоктониоза, фузариоза и белой гнили (R. solani, Sclerotinia minor и F. solani) отмечено при изучении потенциальных биоагентов B. amyloliquefaciens, B. methylotrophicus и B. subtilis [Kai et al., 2007; Schisler et al., 2009, 2012; Catello et al., 2012]. В результате скрининга штаммов бацилл из Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВИЗР и ВКПМ ФГУП НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по признаку антагонистической активности в отношении возбудителей болезней картофеля при хранении авторами были отобраны наиболее перспективные штаммы B. laterosporus Bl101, B. subtilis М-22 и B. subtilis-И5-12/23 [Рой и др., 2005].
Показано, что интенсивность развития болезней картофеля зависит от численности и состава антагонистов. При изучении биоразнообразия и антагонистической активности эпифитных микроорганизмов, выделенных с клубней картофеля, продемонстрировано, что наиболее активны штаммы рода Bacillus [Бельская и др., 1995].
Е. И. Кипрушкиной [2015] проведено детальное исследование возможностей использования бактерий-антагонистов для обработки клубней при холодильном хранении. При обработке клубней штаммами B. subtilis наблюдалась зависимость уровня снижения потерь от сорта картофеля. Показаны адаптивные возможности штамма B. subtilis 413, который после инокуляции присутствовал в составе эпифитной микробиомы клубней картофеля при холодильном хранении. Использование бацилл-антагонистов для обработки клубней привело к продлению сроков хранения, повышению пищевой ценности и последующего увеличения урожайности культуры.
1.4. Взаимодействие Bacillus thuringiensis с фитофагами
Энтомопатогенные бациллы издавна известны как регуляторы численности насекомых в природе. В качестве агентов биологического контроля численности насекомых наиболее часто используются бактерии Bacillus thuringiensis [Гулий и др.,1982; Garczynnski, Siegel, 2007]. Бактерия получила свое окончательное название Bacillus thuringiensis Вerliner в 1911г. после ее выделения Э. Берлинером в Германии (Тюрингия) из мельничной огневки Ephestia kuhniella Zell. и последующей идентификации [Berliner, 1911]. B. thuringiensis как спорообразующая бактерия во время споруляции продуцирует также параспоральный кристаллический белок, обладающий токсическим действием на насекомых. Это свойство и обусловило широкое использование B. thuringiensis как основы экологически безопасных энтомопатогенных препаратов в качестве альтернативы синтетическим химическим пестицидам.
Первоначально штаммы B. thuringiensis выделяли из насекомых отряда чешуекрылых и, соответственно, использовали для контроля численности этих же фитофагов [Heimpel, 1967]. Впоследствии выяснилось, что штаммы B. thuringiensis можно выделять из различных природных субстратов, включая почву, лесную подстилку, больных и погибших насекомых нескольких отрядов, а также с листьев растений и других объектов [Бурцева и др., 2001; Ермолова, 2016]. После продолжительного применения препаратов на основе этой бактерии исключительно против гусениц, в 1977 г. был выделен штамм B. thuringiensis subsp. israelensis, вызывающий заболевание и гибель насекомых отряда двукрылых [Маргалит, Бен-Дов, 2001]. Сначала в качестве хозяев этого подвида рассматривались только кровососущие комары, но впоследствии среди насекомых-хозяев выявились и фитофаги. Через несколько лет в Германии был идентифицирован штамм B. thuringiensis ssp. tenebrionis (morrisoni), токсичный для личинок отряда жесткокрылых [Krieg et al., 1983]. Данный подвид характеризуется пластинчатой формой кристаллов эндотоксина в виде плоских квадратов, прямоугольников и ромбов в отличие от бипирамидальной формы кристалла подвидов, действующих на гусениц или от округлой формы белкового кристалла B. thuringiensis subsp. israelensis.
По мере обнаружения новых изолятов B. thuringiensis как агентов бактериологического подавления численности насекомых произошло разделение бактерии на патотипы (патоварианты) согласно специфичности их энтомоцидного действия на насекомых определенных отрядов [Hofte, Whiteley, 1989; Lereclus et al., 1993]. Наиболее значимы как основа биопрепаратов для биоконтроля численности насекомых три патотипа B. thuringiensis (А, В и С). Подвиды B. thuringiensis, кристаллы которых с наибольшей активностью поражают чешуекрылых, относятся к патоварианту А. В патовариант В включены штаммы, поражающие двукрылых, а в патовариант С - жесткокрылых. Подвиды B. thuringiensis, относящиеся к этим патотипам, чаще всего используются в качестве основы препаратов для биологического контроля насекомых-фитофагов, хотя в целом насчитывается большее число патовариантов B. thuringiensis, в том числе активных в отношении нематод и фитопатогенов [Смирнов, 2000; Bravo et al., 1998].
Рассматриваемый вид спорообразующей энтомопатогенной бактерии продуцирует вторичные метаболиты, активно участвующие в инфекционном процессе. К метаболитам B. thuringiensis относят ферменты, антибиотики и токсины, среди которых, как уже упоминалось, наибольшее значение для контроля численности насекомых имеет белковый d-эндотоксин. Значимую роль в подавлении численности насекомых играет также продуцируемый бактерией во внешнюю среду термостабильный β–экзотоксин нуклеотидной природы [Кандыбин и др.,2009].
Механизм действия дельта-эндотоксина B. thuringiensis на насекомых детально изучен [Bravo et al., 2007, 2013; Pardo-Lopez et al., 2013]. Сначала растворение белкового кристалла в среднем отделе кишечника насекомого происходит под действием щелочного рН кишечника. Высвобождающиеся полипептиды – протоксины имеют молекулярную массу (м.м.) 130 кДа для патоварианта А и 67 кДа – для патовариантов В и С. Следующая более важная стадия – активация под действием сериновых протеаз. Протоксины превращаются в истинные токсины, уменьшаясь в размерах примерно вдвое за счет отщепления N-терминальных аминокислотных остатков. Последовательно повышается инсектицидная активность получаемых токсинов. Интактный кристалл в 3,5 раза менее активен, чем протоксин, который, в свою очередь, в 6 раз менее активен, чем истинный токсин [Luthy, Wolfersberger, 2000]. Истинный токсин является по современной номенклатуре Cry-токсином. В настоящее время известно большое количество продуцируемых B. thuringiensis дельта-эндотоксинов. Это разнообразие обусловлено генетической пластичностью B. thuringiensis. В результате многочисленных работ по получению инсектицидных белков (путем включения кодирующих их генов в геном бактерии кишечной палочки), потребовалась систематизация как генов, так и продуцируемых ими токсинов B. thuringiensis. Во всем мире пользуются номенклатурой, предложенной группой ученых во главе с Н. Крикмор [Crickmore, 2000; Crickmore et al., 1998, 2014]. Гены, кодирующие инсектицидные белки дельта-эндотоксина, обозначены как cry, а сами токсины как Cry (cокращение от английского crystal – кристалл). В дополнение к инсектицидным Cry-белкам обнаружены цитолитические Cyt-белки у диптеро-специфичных штаммов (B. thuringiensis subsp. israelensis) [Маргалит, Бен-Дов, 2001; Ben-Dov, 2014]. В основу номенклатуры токсинов положен принцип алгоритмов филогенетического дерева. Присвоенные генам и белкам ранговые цифры и буквы указывают на степень филогенетического расхождения, что отражается в последовательности аминокислот в белке. Каждый токсин именуется по четырем рангам (арабские буквы), например, Cry1Ab или Cyt2Ba. Наименование зависит от местонахождения в филограмме, демонстрирующего степень идентичности аминокислотной последовательности между белками. Филограмма, а также список Cry и Cyt-белков представлены в обзорах [Crickmore et al., 1998; 2014; Schnepf et al., 1998]. Многие штаммы B. thuringiensis образуют более одного Cry-токсина, включенных в один кристалл дельта-эндотоксина [Luthy, Wolfersberger, 2000]. Cry и Cyt- белки относятся к классу PFT-токсинов (pore-forming toxins), образующих поры в клеточных мембранах [Bravo et al., 2007]. К белкам, токсичным для Lepidoptera, относятся, например, Cry1 и Cry9, для Coleoptera – Cry3, Cry7 и Cry8, а для Diptera – Cry11, Cry21 и Cyt-белки (Bravo et al., 2007).
Структура Cry- токсинов тесно связана с механизмом их действия. Эта структура включает три домена (рис. 1.3).
|
