Энзимология
|
Скачать 0.9 Mb.
|
|
Раздел 1. Структура и свойства ферментов РАБОТА 1.1. Выделение и очистка каталазы из пшеничных зародышей В настоящее время получение ферментов путем выделения их из биологических объектов является единственно реальным, несмотря на то, что уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов – рибонуклеазы, лизоцима, ферредоксина и цитохрома с, поскольку синтетическое получение ферментов является слишком сложным и дорогим. Выделяют ферменты так же, как и другие белки. Тем не менее есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов – это экстракция глицерином для сохранения нативных свойств ферментов, метод ацетоновых порошков (осаждение и быстрое обезвоживание при температуре -10°С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты), адсорбция с последующей элюцией с адсорбента, метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, электрофорез и изоэлектрофокусирование. Одной из модификаций адсорбционного метода является афинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему выходят с током проявителя. При изменении характера проявителя исследуемый фермент элюирует с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноэтажную (аффинная сорбция – элюция) схему выделения. Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала, вплоть до разрушения субклеточных структур (лизосом, митохондрий, ядер и др.), которые несут в своем составе индивидуальные ферменты. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с потерей ферментативной активности. Этому способствует проведение операций в присутствии защитных добавок, в частности SH-содержащих соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цистеамина, дитиотреитола и др.). Очень важно поддерживать на всех этапах выделения ферментов низкую температуру, так как некоторые из них при повышенной температуре теряют свою активность. Для оценки гомогенности ферментного препарата прибегают к обычным методам белковой химии. Переломным моментом в усовершенствовании методов получения высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов было открытие способности их кристаллизоваться, осуществленное впервые в 1906 г. А. Д. Розенфельдом. О степени чистоты ферментного препарата судят по его биологической активности; если активность при дальнейшей очистке не возрастает, препарат можно считать гомогенным. Из 3709 включенных в список ферментов более 1500 выделено и очищено, третья часть их закристаллизована, у нескольких сотен выяснена первичная, а у нескольких десятков – третичная структура. В исследовании конформации ферментов обязательным требованием является получение препарата высокой степени чистоты. Изучение литературных данных и общих рекомендаций по очистке ферментативных препаратов позволило разработать методику получения препарата каталазы из пшеничных зародышей, включающую приготовление экстракта, осаждение этанолом при концентрации 60% (для получения спиртоосажденного препарата с наибольшей удельной активностью), фракционирование сульфатом аммония при насыщении 60–80%, гель-фильтрация на сефадексе G-25 и G-100. Выделение и очистка каталазы Исследуемый материал: зародыши пшеницы Реактивы: 0,15 М фосфатный буфер (рН 7,4); 0,15 М фосфатно-цитратный буфер (рН 7,4); 90%-ный этанол; сульфат аммония; сефадекс G-25; сефадекс G-100; стандартные белки с молекулярной массой около 300 кДа, 200 кДа и 100 кДа. Оборудование: пробирки, пипетки, рефрижераторная центрифуга, хроматографические колонки, колбы Ход работы:Препарат каталазы получают в виде вытяжки из тонкоизмельченных пшеничных зародышей. Для этого 5 г зародышей пшеницы тщательно растирают в фарфоровой ступке пестиком до получения однородной массы. Измельченные зародыши заливают 20 мл 0,15 М фосфатным буфером (рН 7,4). Гомогенат центрифугируют при 2000 g (4ºС). В супернатанте определяют белок микробиуретовым методом (см. раздел 6) и активность каталазы. На первой стадии очистки фермент осаждают 60% этанолом. Для этого к 10 мл супернатанта добавляют 20 мл 90% этанола. Полученный осадок растворяют в 20 мл 0,15 М фосфатно-цитратного буфера, рН 7,4. В экстракте определяют активность каталазы и содержание белка микробиуретовым методом (см. работу 5.4.2). Степень очистки фермента после этой процедуры становится равной 2,38. Затем фермент освобождают от балластных белков добавлением к 20 мл экстракта 14 г сульфата аммония. После фракционирования осадок растворяют в 15 мл фосфатно-цитратного буфера. В экстракте определяют активность каталазы и содержание белка микробиуретовым методом (см. работу 6.4.2). Фракционирование сульфатом аммония в пределах насыщения 60–80% позволяет получить препарат каталазы с удельной активностью 55,9 ед./мг белка; степень очистки при этом возрастает в 8 раз по сравнению с удельной активностью каталазы в гомогенате. Для освобождения ферментного раствора от низкомолекулярных примесей осуществляют гель-фильтрацию на сефадексе G-25. В фильтрате определяют активность каталазы и содержание белка спектрофотометрическим методом (см. раздел 5). Степень очистки возрастает в 1,65 раза, а удельная активность каталазы при этом составляет 92,1 ед./мг белка. Затем осуществляют гель-фильтрацию на сефадексе G-100. Раствор белка, выходящий из колонки, собирают в несколько фракций по 1,0-1,5 мл и в них проводят определение белка спектрофотометрическим методом (см. работу 6.4.4) и активности каталазы. Наиболее активные фракции объединяют. Удельная активность ферментного препарата каталазы, полученного по данной схеме, составляет 545,2 ед./мг белка, степень очистки – 78,46. Молекулярная масса каталазы зародышей пшеницы, определенная гель-хроматографическим методом на сефадексе G-100, составляет 250 ± 1,5 кДа. Определение молекулярной массы каталазы методом гель-фильтрации В основе метода определения молекулярной массы белков с применением гель-фильтрации лежит следующий эмпирический факт. Установлено, что объемы элюирования различных белков с одинаковыми молекулярными массами на одной и той же колонке в идентичных условиях практически совпадают. Это позволяет определять молекулярную массу неизвестного белка, если колонка с гелем предварительно проградуирована (прокалибрована). Калибровка состоит в определении объемов элюирования нескольких чистых белков с известной молекулярной массой. Полученные данные наносят на график в виде зависимости логарифма молекулярной массы (ММ) от объема элюирования (Ve). Такие зависимости в пределах одного – полутора порядков по величине молекулярных масс имеют, как правило, линейный вид. В качестве примера, на рис. 1.1.1. приведен такой график для ряда белков.  Рисунок – 1.1.1. Логарифмическая зависимость объёма элюирования от молекулярной массы белков Определение активности каталазы Для определения активности каталазы используют один из предложенных методов. 1. Определение активности каталазы с помощью йодистого калия Принцип метода основан на образовании комплекса неразрушенного пероксида водорода с йодистым калием. Реактивы: 3%-ный раствор иодистого калия в 50%-ном ацетоне (50 мл 3%-ного раствора иодистого калия растворяют в 50 мл ацетона); 3%-ный раствор перекиси водорода. Оборудование: пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы (10 мм) Ход работы: К 0,1 мл исследуемой пробы приливают 10 мл 3%-ной перекиси водорода и 10 мл 3%-ного раствора иодистого калия в 50%-ном ацетоне. Раствор фотоколориметрируют на синем светофильтре с длиной волны 435-445 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Активность каталазы определяют по формуле:  , гдеA – активность каталазы в пробе; D – оптическая плотность исследуемой пробы; 0,02 – коэффициент перевода в условные единицы каталазы. 2. Определение активности каталазы с помощью молибдата аммония Принцип метода основан на способности пероксида водорода взаимодействовать с солями молибдена, образуя стойкий окрашенный комплекс. Реактивы: 30 мМ трис-HCl буфер (рН 7,4); Н2О2; дистиллированная вода; 4%-ный раствор молибдата аммония. Оборудование: пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы (5 мм). Ход работы: В опыте используют холостую, контрольную и опытную пробы. В каждую пробу вносят по 1 мл трис-HCl буфера. Затем в холостую и опытную пробу добавляют по 2 мл пероксида водорода, а в контрольную – 2 мл дистиллированной воды. После этого в контрольную и опытную пробы доливают по 0,1 мл препарата каталазы и оставляют пробы при комнатной температуре в темноте. Реакцию останавливают через 10 минут добавлением во все пробирки 1 мл 4%-ного раствора молибдата аммония. После этого в холостую пробу приливают 0,1 мл препарата каталазы. Интенсивность окраски в каждой пробе измеряют на ФЭКе при длине волны 410 нм против контрольной пробы. Активность каталазы рассчитывают по формуле:  А – активность мкмоль Н2О2/мин*г белка Ех – изменение оптической плотности холостой пробы за 10 минут; Ео – изменение оптической плотности опытной пробы за 10 минут; Vрс – объём реакционной среды (по методике = 3,01 мл); t – время регистрации оптической плотности, равное 10 минут; К - коэффициент микромолярной экстинкции для Н2О2 при длине волны 400 нм, равный 22,210-3 мкМ-1см-1; Vпр – объём пробы; d – длина оптического пути кюветы (0,5 см). РАБОТА 1.2. Влияние рН и температуры на активность каталазы (2 ч.) Каталаза (КФ 1.11.1.6 пероксид водорода: пероксид водорода оксидоредуктаза) – двухкомпонентный фермент, состоящий из белка и соединенной с ним простетической группы. Это хромопротеин с молекулярной массой около 240 кДа, состоит из 4-х субъединиц, имеющих по одной группе гема. Каталазная активность в клетках животных сосредоточена в основном в пероксисомах, которые содержат также ферменты, образующие Н2О2: глюкозооксидазу, уратоксидазу и флавопротеиндегидрогеназу. Частично каталаза локализуется в микросомах и в меньшей мере – в цитозоле. Полагают, что каталаза не имеет высокого сродства к Н2О2 и не может эффективно обезвреживать это соединение при низких концентрациях, имеющихся в цитозоле. В пероксисомах, где концентрация Н2О2 высока, каталаза, напротив, активно разрушает ее. В эритроцитах, где активность каталазы максимальна, фермент находится в комплексе с NАDPН, который не является необходимым для проявления каталитической активности, но предотвращает инактивацию фермента. Каталаза предотвращает накопление в клетке пероксида водорода, образуемого при аэробном окислении восстановленных флавопротеинов, который в присутствии двухвалентного железа может генерировать гидроксильный радикал, являющийся особо агрессивной активной формой кислорода. Определение активности каталазы в этой работе осуществляли спектрофотометрическим методом. Принцип метода каталаза катализирует разложение пероксида водорода по реакции: 2 Н2О2 → 2 Н2О + О2 О ходе реакции судят по изменению концентрации пероксида водорода в пробе спктрофотометрическим методом при длине волны 230 нм, максимуме поглощения Н2О2. В качестве источника фермента можно использовать гомогенаты тканей, клетки крови, биологические жидкости, субклеточные органеллы. Реактивы:
С = 141 х (ОД2 – ОД1). При необходимости раствор пероксида водорода разводят. Оборудование: спектрофотометр Specol, набор автоматических пи петок, пробирки, мерные колбы, кварцевые кюветы. Ход работы: Для определения активности каталазы готовят две пробы – контрольную и опытную в соответствии с таблицей. Таблица 1.2.1. Содержание проб для определения активности каталазы
Реакцию запускают внесением в пробу, находящуюся в спектрофотометрической кювете с расстоянием между рабочими гранями 1,0 см, гемолизата. Содержимое кюветы перемешивают и определяют начальную оптическую плотность. За ходом реакции следят в течение 3 минут. Регистрацию оптической плотности проводят при комнатной температуре. Влияние рН среды на активность каталазы исследуют во фракциях молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе у интактных кроликов. Фракционирование эритроцитов осуществляют по разработанной на кафедре методике (см. 5.2). Определение активности каталазы проводят при вышеописанных условиях в 1М трис-HCl буфере при рН 5, 6, 7 и 8. Изучение влияния температуры на активность каталазы проводят в гемолизатах, приготовленных из каждой фракции клеток, которые делят на пять равных частей. Каждую отобранную аликвоту гемолизата подвергают инкубации при определенной температуре в течение 10 мин. Затем пробы резко охлаждают и центрифугируют 20 мин при 1700 g. Обработанные таким способом гемолизаты добавляют в реакционную смесь в качестве источника фермента. Исследования проводят в температурном диапазоне 20°С – 60°С с шагом в 5°С. Полученные результаты представляют в виде рН-зависимостей и графиков Аррениуса. Рассчитывают коэффициент Q10. РАБОТА 1.3. Влияние концентрации пероксида водорода на активность каталазы (2 ч.) Зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата почти всегда выражается в виде кривой, близкой по форме к одно из ветвей равнобочной гиперболы. Таким образом, при низком содержании субстрата в системе наблюдается отчетливая зависимость между его концентрацией и скоростью реакции. При больших концентрациях субстрата подобное явление отсутствует. Постоянную скорость, наблюдаемую в реакции при избытке субстрата, полностью насыщающего фермент, называют максимальной скоростью энзиматической реакции. При очень высоких концентрациях субстрата может наблюдаться субстратное ингибирование, обусловленное образованием непродуктивного комплекса фермента с несколькими молекулами субстрата. Изучение влияния концентрации пероксида водорода на скорость реакции, катализируемой каталазой проводят постоянной концентрации фермента (гемолизат, приготовленный из отмытых от плазмы упакованных эритроцитов, разведение 1:49) и варьируемых концентраций субстрата (Н2О2). В работе используют следующие концентрации пероксида водорода: 3%-ная, 0,6%; 0,3%; 0,15%; 0,06%; 0,03%; 0,015%. Для определения активности каталазы используют метод с молибдатом аммония. По результатам исследования строят график зависимости скорости реакции от концентрации пероксида водорода и делают выводы. РАБОТА 1.4. Зависимость скорости реакции, катализируемой каталазой от количества ферментного белка (2 ч.) Скорость энзиматической реакции зависит прежде всего от природы фермента, характеризующегося низкой или высокой активностью. При прочих равных условиях и при наличии избытка субстрата и кофакторов начальная скорость энзиматической реакции пропорциональна концентрации фермента: v = k [E], где k – константа скорости, v – скорость, [E] – концентрация фермента. При графическом изображении получается прямая линия, если по оси абсцисс откладывать концентрацию фермента, а по оси ординат – соответствующую ей величину начальной скорости реакции. Изучение влияния концентрации фермента на скорость реакции, катализируемой каталазой проводят постоянной концентрации субстрата (пероксида водорода) и варьируемых концентраций фермента (источник каталазы – гемолизат, приготовленный из отмытых от плазмы упакованных эритроцитов). В работе используют гемолизаты со следующими разведениями: 1:5; 1:9; 1:24; 1:49; 1:74; 1:100. Для определения активности каталазы используют метод с молибдатом аммония. По результатам исследования строят график зависимости скорости реакции от концентрации фермента и делают выводы. РАБОТА 1.5. Механизм действия аминотриазола на каталазу (2 ч.) Активность каталазы ингибируется различными веществами, включая ее природный субстрат, пероксид водорода (Н2О2), азидом натрия, уксусной кислотой, цианидами, тяжелыми металлами и 3-амино-1,2,4-триазолом (АТ). Аминотриазол является необратимым ингибитором реакции, катализируемой каталазой. В работе используют различные источники фермента: печень крысы, очищенный препарат каталазы из зародышей пшеницы (работа 1.1), кровь крысы (кролика). Забор крови у крысы (кролика) и последующую ее обработку для получения эритроцитов проводят согласно описанию в разделе 5.1.2. Из отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов готовят гемолизат (эритроциты : дистиллированная вода, охлажденная до 00, разведение 1 : ). Приготовление гомогената печени (250 мг ткани + 5 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия) см. в разделе 5.1.3. Содержание белка в препарате фермента из печени, зародышей пшеницы и гемолизате осуществляют микробиуретовым методом ( раздел 5.4.2). Инкубацию препарата фермента с АТ проводят в термостате при 370 С в течение часа при постоянном перемешивании для контакта инкубационной смеси с кислородом. Используя концентрации аминотриазола 20 мМ определить: 1) является ли АТ ингибитором для каталазы из различных источников; 2) степень ингибирования фермента; 3) в различных препаратах. Использовать спектрофотометрический метод (см. работу 1.2) для определения активности каталазы. |