2. После этого разводим лимфоциты до нужной концентрации. В связи с тем, что моноциты адсорбируются на поверхности стеклянной пробирки, то данным методом выделяются именно лимфоциты.
Например, если количество подсчитанных клеток в 5-ти больших квадратах равно 100 и нужна концентрация 1 млн/мл, то считаем следующим образом:
1  00 клеток - 0,02*10-3 мл
Х клеток - 1 мл
Следовательно 5 млн лимфоцитов содержится в 1 мл исследуемой смеси. Таким образом, для приготовления смеси с заданной концентрацией (в данном примере 1 млн/мл), необходимо произвести разведение в 5 раз, то есть взять одну часть смеси с концентрацией 5000000 и 4 части среды для разведения.
5.4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА
Для количественного определения белков используют физические, химические и биологические методы.
Из физических методов простейшим является взвешивание чистого белка. Однако белки очень гигроскопичны, и полностью удалить из их состава воду очень трудно, поэтому этот способ применяют редко.
Наибольшее распространение из физических методов количественного определения белков получили три – рефрактометрический (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по поглощению в ультрафиолетовой области спектра) и полярографический (по кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок), пикнографический метод (по плотности белковых растворов).
Химические методы количественного определения белков разнообразны. Наиболее простой химический метод определения – количественное определение общего или белкового (после осаждения белка и отделения его от растворимых азотсодержащих веществ) азота.
Самым распространенным методом количественного определения белков является колориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности цветных реакций, развивающихся при взаимодействии белков с тем или иным специфическим реагентом. Чтобы рассчитать концентрацию белка, строят калибровочный график.
Биологические методы количественного определения белков применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической активности препарата, можно составить представление о содержании в нем белка, обладающего данной активностью. Этот метод не дает абсолютных результатов.
Биуретовый метод
Принцип метода: биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодействии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.
Исследуемый раствор: стандартный раствор белка, содержащий 10 мг в 1 мл.
Реактивы: биуретовый реактив – 0,15 г CuSO4 5H2O и 0,6 г NaKC4H4O6·4H2O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н2О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-ного раствора NaOH (свободного от Na2CO3), добавляют 0,1 г КI и доводят водой до 100 мл. Хранят в полиэтиленовой склянке.
Оборудование: пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы с длиной светового пути 5 мм.
Ход работы: в 4 сухие пробирки вносят по 0,5 мл раствора белка. В три пробирки помещают стандартные растворы с содержанием белка 2,5; 5,0; 7,5 мг в 1 мл. Эти пробирки служат для построения калибровочной кривой. В 4-ю пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую необходимо определить.
В каждую пробирку добавляют по 2 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин для развития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с длиной оптического пути 5 мм, пользуясь зеленым светофильтром (длина волны 540 нм). В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе используют биуретовый реактив.
Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат – соответствующие значения оптической плотности. Зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой определяют в нем содержание белка.
Микробиуретовый метод
Принцип метода: биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодействии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.
Исследуемый материал: стандартный раствор белка, содержащий 1 мг в 1 мл.
Реактивы: биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедикта) – 17,3 г цитрата натрия и 10 г Na2CO3 растворяют при подогревании в небольшом количестве воды, в раствор добавляют 1,73 г сульфата меди, растворенного в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл; 6%-ный раствор NaOH.
Оборудование: пробирки, пипетки, спектрофотометр, кюветы
Ход работы: к 2 мл раствора, содержащего 0,1-2,0 мг белка, добавляют 2 мл 6%-ного раствора NaOH и 0,2 мл раствора Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 530 нм на спектрофотометре. Предварительно строят график по стандартному раствору белка.
Метод Брэдфорда
Принцип метода: метод основан на связывании с белками одного из кислых красителей кумасси синего. При связывании с белками спектр поглощения красителя меняется. Интенсивности окраски от концентрации белка в пробе в диапазоне 1-10 мкг/мл имеет линейную зависимость. Поскольку белки различаются по своей способности связывать красители, желательно строить калибровочный график с использованием того белка, концентрацию которого в дальнейшем предполагают определить.
Исследуемый материал: стандартный раствор белка, содержащий 0,05 мг/мл.
Реактивы: раствор красителя – 10 мг кумасси G-250 гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе в 5 мл 95%-ного спирта, полученный раствор смешивают с 10 мл 95%-ной фосфорной кислоты, разводят до конечного объема 100 мл. Отфильтрованный раствор красителя хранится около 2 недель.
Оборудование: пробирки, пипетки, спектрофотометр, кюветы.
Ход работы: 1,5 мл раствора, содержащего от 10 до 50 мкг белка, смешивают с 1,5 мл раствора красителя. Через 3-5 мин измеряют оптическую плотность при 595 нм, используя в качестве контроля пробу, не содержащую белка. В описанной модификации А595 линейно зависит от количества белка в интервале от 10 до 50 мкг.
Спектрофотометричекий метод
Метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина, фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом при 280 нм. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, находят количество белка в растворе. Поскольку белки отличаются по содержанию ароматических аминокислот, их поглощение в ультрафиолетовой области спектра может сильно различаться. Условно считают, что при концентрации «усредненного» белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0 (при толщине кюветы 1,0 см).
Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов, поэтому измеряют оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм.
Исследуемый материал: стандартный раствор белка, содержащий 1-5 мг/мл.
Оборудование: пробирки, пипетки, спектрофотометр, кюветы
Ход работы: содержание белка находят по формуле Калькара на основе данных определения оптической плотности при 280 и 260 нм:
Содержание белка (мг/мл) = 1,45 * А280 – 0,74 * А260
Библиографический список
Авраамова Т.В., Титова Н.М. Руководство по большому биохимическому практикуму: Углеводный обмен.- Красноярск, 1978.- Ч.1.- C.90-92.
Керридж Д., Типтон К. Биохимическая логика.- М.: Мир, 1974.- 328с.
Дотхоев Д.С. Особенности проницаемости эритроцитарных мембран и сорбционная способность эритоцитов у здоровых доношенных детей и их матерей/ Д.С. Дотхоев// Физиология человека.- 1998.- Т.24, №2.- С.135-137.
Каган В.Е. Проблемы анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов/ В.Е. Каган, О.Н. Орлов, Л.Л. Прилипко.- «Биофизика» (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР).- М., 1986.- Т.18.- 136с.
Колмаков В.Н. Значение определения проницаемости эритроцитарных мембран в диагностике хронических заболеваний печени/ В.Н. Колмаков, В.Г. Радченко// Терапевт. архив.- 1982.- №2.- С.59-62.\
Медицинские лабораторные технологии:Справочник/ под ред. А.И. Карпищенко. – СПб: Интермедика, 1999. – 656с.
Меньшиков В.В. Справочник по клиничексим лабораторны методам исследования/ В.В. Меньшиков.- М.: Медицина, 1987.- 460с.
Михайлович В.А. Проницаемость эритроцитарных мембран и сорбционная способность эритроцитов - оптимальные критерии тяжести эндогенной интоксикации/ В.А. Михайлович, В.Е. Марусанов, А.Б. Бичун// Анестезиология и реаниматология.- 1993.- №5.- С.66-69.
Паранич Л.И. Действие нитробензола и его хлорпроизводных на некоторые показатели антиокислительного гомеостаза в тканях крыс/ Л.И. Паранич, А.В. Паранич, Н.М. Василенко, Е.В. Бугай// Бюлл. эксперим. биол. и медицины.- 1993.- Т.CXVI, №10.- С.402-405.
Справочник биохимика: Пер. с англ./ Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К.- М.: Мир, 1991.- 544 с., ил.
Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида / Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г.// Современные методы в биохимии под ред. Ореховича В. Н.-М., 1977.- С. 66-68.
Тогайбаев А.А. Способ диагностики эндогенной интоксикации/ А.А. Тогайбаев, А.В. Кургукин, И.В. Рикун, Р.М. Карибжанова// Лаб. дело.- 1988.- №9.- С.22-25.
Beutler E. Red cell metabolism a manual of biochemical methods/ E. Beutler.- Grune & Stration, Orlando, 1990.- P.131-134.
Ko K.M. Ferric ion-induced lipid peroxidation in eryhtrocyte membranes: effects of phytic acid and butylated hydroxytoluene/ K.M. Ko, D.V. Godin// Mol. and Cell. Biochem.- 1990.- N10.- P.125-131.
ПРИЛОЖЕНИЕ
1. Способы количественного выражения активности ферментов и содержания внутриклеточных метаболитов
Общепринято активность ферментов и содержание внутриклеточных метаболитов выражать на мл упакованных клеток, на грамм (мг) белка, на грамм (мг) гемоглобина (в случае использования эритроцитов) или на число клеток. В связи с этим, в расчётных формулах, необходимо вводить такие параметры, как величина гематокрита (см. раздел 5), содержание белка (гемоглобина) (см. раздел 6), количество клеток (см. раздел 5).
Е на мл эритроцитов =  :
Е на 1011 эритроцитов =  ;
Е на гр.Нb =  ;
где  – изменение абсорции за 1 минуту;
V-общий объём инкубационной пробы в мл;
f – фактор разведения гемолизата;
ε – коэффициент экстинции;
l – длина оптического пути кюветы, в см.;
V – объём добавленного гемолизата, в мл.
2. Расчёт центрифужного поля
Центрифужное поле (g) можно вычислить по формулам (1) (2):
(1) g = 1118 * 10-8 * R * N2,
где R (см) – радиус от центра ротора центрифуги до точки, в которой необходимо вычислить центрифужное поле;
N (об/мин) – скорость вращения ротора.
(2) g = 284 * 10-7 * R * N2,
где R (дюймы) – радиус от центра ротора центрифуги до точки, в которой необходимо вычислить центрифужное поле;
N (об/мин) – скорость вращения ротора.
Пересчёт об/мин в g для центрифуги ОПН-3:
1500 об/мин = 430 g
3000 об/мин = 1700 g
Пересчёт об/мин в g для центрифуги ОПН-8:
8000 об/мин = 6000 g
3. Приготовление инкубационной среды
При исследовании метаболизма клеток крови необходима долговременная их инкубация, которая требует использования инкубационных сред различного состава. В качестве таких сред наиболее часто используют раствор Кребс-Рингера, среду Хенкса и среду 199.
Раствор Кребс-Рингера.
Раствор Кребс-Рингера готовят смешиванием следующих растворов:
1). 2 мл 0,6 М NaCl,
2). 1 мл 56 мМ KCl,
3). 1 мл 20 мМ MgCl2,
3). 1 мл 20 мМСаСl2,
4). 1 мл 10 мМ Na2HPO4,
5). 4 мл 60 мМ трисHCl-буфера, рН 7,4,
Глюкоза добавляется в среду в виде порошка и непосредственно перед началом инкубации. Конечная концентрация глюкозы должна составлять 10 мМ. В случае инкубации упакованных эритроцитов соотношение среды Кребс-Рингера и клеток составляет (2:1).
Среда Хенкса и среда 199 обычно используются уже готовые.
4. Приготовление раствора Олсвера
Олсвера раствор – раствор, предназначенный для сохранения эритроцитов. Состав: 24,6 г глюкозы, 9,6 г натрия цитрата, 5,04 г натрия хлорида, 1200 мл дистил. воды. Стерилизуют фильтрованием. Для консервации эритроцитов барана 1 ч. крови смешивают с 1 ч. О.р.; эритроцитов человека, морской свинки, кур - 5 ч. крови с 1 ч. О.р. Эритроциты пригодны в течение 8-12 дней. С этой целью также применяют азид натрия, боратный буфер с сорбитом, гипертонический р-р натрия хлорида, рН 6,0 - 6,4 (Ричардсона м-д).
ОГЛАВЛЕНИЕ
|
|
Рабочая программа курса «Энзимология»
|
3
|
Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
|
9
|
Раздел 1. Структура и свойства ферментов
1.1. Выделение и очистка каталазы из пшеничных зародышей
1.2. Влияние рН и температуры на активность каталазы
1.3. Влияние концентрации пероксида водорода на активность каталазы
1.4. Зависимость скорости реакции, катализируемой каталазой от количества ферментного белка
1.5. Механизм действия аминотриазола на каталазу
Раздел 2. Механизмы ферментативного катализа
2.1. Природа субстрата и активность глутатион-S-трансферазы
2.2. Специфичность действия малатдегидрогеназы
Раздел 3. Контроль активности и компартментализация ферментов
3.1. Оценка активности мембраносвязанной и цитозольной форм глутатионпероксидазы
3.2. Аллостерическая регуляция глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы
3.3. Денситометрический метод выявления локализации сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах
Раздел 4. Прикладное значение ферментов
4.1. Определение активности трансфераз в сердечной мышце и печени крысы на биохимическом анализаторе Сапфир 400
4.1.1. Автоматический биохимический анализатор Сапфир 400
4.1.2.Определение активности трансфераз
Раздел 5. Вспомогательные методы
5.1. Основные приёмы работы с биологическими объектами
5.2. Фракционирование эритроцитов и определение некоторых гематологических параметров
5.3. Определение количества клеток крови в камере Горяева
5.4. Методы определения количественного содержания белка
Библиографический список
Приложение
|
11
11
16
18
19
19
20
20
21
25
25
27
30
34
34
34
37
42
42
44
47
52
56
57
|
Учебное издание
Подготовлено к изданию РИО БИК СФУ
Подписано в печать 2012 г. Формат 60х84/16
Бумага офсетная. Печать плоская
Усл. печ. л. Уч.-изд. л.
Тираж экз. Заказ (дает РИО)
Редакционно-издательский отдел
Библиотечно-издательского комплекса
Сибирского федерального университета
660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79
Тел/факс (391) 206-21-49. E-mail rio@sfu-kras.ru
http://rio.sfu-kras.ru
Отпечатано Полиграфическим центром
Библиотечно-издательского комплекса
Сибирского федерального университета
660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а
Тел. 206-26-58, 206-26-49
|