Энзимология
|
Скачать 0.9 Mb.
|
|
РАЗДЕЛ 5. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ 5.1. ОСНОВНЫЕ ПРИЁМЫ РАБОТЫ С БИОЛОГИЧЕСКИМИ ОБЪЕКТАМИ Для исследования различных биохимических параметров in vitro широко используются клетки и плазма крови, а также различные ткани экспериментальных животных. Наиболее часто в таких экспериментах используются лабораторные животные – кролики, крысы и мыши. Прижизненное взятие крови у кролика Интактные и опытные кролики могут быть донорами до 2 лет. Кровь берут из краевой вены уха кролика капельным методом. На внутренней поверхности уха в середине сбривают шерсть на участке 11 см вблизи локализиции краевой вены и протирают оголённую кожу спиртом. 1. Делают неглубокий поперечный надрез вены бритвой. К месту разреза подставляют пробирку и протирают его сухой стерильной ватой. 2. Если процедура сделана правильно и кролик спокоен, кровь по каплям начинает собираться в пробирку. Кролика желательно укрыть тканью, чтобы ему было тепло. 3. Обычно берут 10-20 мл крови без дополнительного введения физиологического раствора с глюкозой. Если требуется большее количество крови (50 мл), то после её взятия для восполнения потери жидкости необходимо ввести внутривенно физиологический раствор. 4. По окончанию забора крови рану зажимают ватным тампоном до прекращения кровотечения. В случае глубокого надреза ушной вены и невозможности остановки кровотечения обычным способом используется тромбопластин. Примечание: При заборе крови нужно чётко представлять, какая именно составная часть крови будет использована для проведения эксперимента. Для работы могут быть использованы как сами клетки (ретикулоциты, эритроциты, лимфоциты, тромбоциты), так и жидкая часть крови (сыворотка или же плазма крови). !Сыворотка – это плазма крови, лишённая фибриногена! В сыворотке крови фибриноген превращается в фибрин, в плазме же этому превращению препятствует антикоагулянт (см. ниже). Получение сыворотки, плазмы и эритроцитов крови Для получения сыворотки забор крови осуществляется в чистую сухую пробирку. Пробирку закрывают ватной пробкой и ставят в термостат на 30 минут (36С). 1.Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки, вновь закрывают ватной пробкой и ставят в холодильник (4С) на 12 часов. 2.Полученную сыворотку центрифугируют при 5000 g в течение 5 мин. Отделившаяся от осадка сыворотка должна быть прозрачной, желтоватого цвета (розовый цвет говорит о том, что в сыворотку попали лизированные эритроциты). 3.Сыворотку следует хранить при температуре не выше -20С. При разморозках активность сыворотки резко падает, поэтому её хранят небольшими порциями – аликвотами (0,2-0,5 мл) и размораживают один раз, используя в опытах по мере необходимости. Для получения плазмы и клеток крови обязательным условием является использование консервантов крови ((гепарин, цитрат натрия, динатриевая соль этилендиаминтетраацетата (трилон Б) или раствор Олсвера)), чтобы воспрепятствовать образованию тромба. Чаще всего, в качестве антикоагулянта используют гепарин. В центрифужную пробирку вносят несколько капель антикоагулянта (примерное соотношение крови и гепарина 1/5) и равномерно распределяют его по дну и стенкам пробирки. Только после этого в пробирку можно набирать кровь. Гепаринизированную кровь центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин. (1700g). После центрифугирования убирают слой плазмы и тонкую белую лейкоцитарную пленку. Плазму отбирают отдельно и сохраняют. Плазму следует хранить при температуре не выше -20С. При разморозках активность плазмы резко падает, поэтому её хранят небольшими порциями – аликвотами (0,2-0,5 мл) и размораживают один раз, используя в опытах по мере необходимости. Оставшуюся после отбора плазмы эритроцитарную массу трижды отмывают физиологическим раствором (0,9%-ным NaCl) и центрифугируют по 15 минут при 3000 об/мин. (1700g). Супернатант отбрасывают. Последнее центрифугирование проводят в течение 20 минут для более плотной упаковки клеток (Авраамова, Титова, 1978). Приготовление гомогенатов тканей Для получения гомогенатов ткани взвешиваются на электронных весах и гомогенизируютя в физиологическом растворе с помощью стеклянного гомогенизатора в течение 5 - 10 минут (240 -250 мг ткани + 5 мл 0,9%-ного раствора NaCI). Все операции проводятся на холоде. Гомогенат центрифугируют при 5-6 тыс. об/мин в течение 30 минут. Полученный супернатант используется в дальнейших методиках Приготовление лизированных клеток Клетки лизируют добавлением определённого объёма отмытых от плазмы и упакованных клеток к рассчитанному объёму дист. воды, охлаждённой до 0С. Для приготовления лизата клеток разведением в Х раз (или 1:(Х-1)) нужно 1 часть клеток добавить к (Х-1) частям дист. воды. Например, для приготовления лизата клеток разведением в 10 раз (или 1:9) нужно 1 часть клеток добавить к 9 частям дист. воды. Например, для приготовления лизата клеток разведением в 10 раз (или 1:9) и объёмом 20 мл нужно 2 мл клеток (1*2=2) добавить к 18 (9*2=18) мл дист. воды. 5.2. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ Фракционирование эритроцитов Фракционирование эритроцитов проводили по методу, разработанному на кафедре биохимии и физиологии человека и животных Красноярского государственного университета. Принцип метода основан на том, что старение эритроцитов сопровождается увеличением удельного веса данных клеток. Поэтому при центрифугировании цельной крови происходит распределение эритроцитов в соответствии с их удельным весом. В верхней части эритроцитарного столба собираются наиболее молодые клетки, в нижней части – наиболее старые. Часть свежей гепаринизированой крови, отливали для исследования – нефракционированная кровь (общая эритроцитарная масса), оставшуюся часть подвергали фракционированию. После 20-минутного центрифугирования крови при 1000g при 40С осторожно отбирают плазму и сохраняют для дальнейшего фракционирования эритроцитов. Затем тщательно собирают и отбрасывают лейкоциты, верхнюю половину эритроцитарного столба переносят в новую пробирку. Эритроциты ресуспендируют до 50%-ного гематокрита и подвергают центрифугированию при тех же условиях. После отбора плазмы верхнюю половину эритроцитарного столба отбирают в пробирку. Процедуру отбора верхней половины эритроцитарного столба, взвешивания отобранных эритроцитов и центрифугирования повторяют четыре раза, затем снимают 1 мл эритроцитов, расположенных в самой верхней части эритроцитарного столба (верхний слой или фракция молодых клеток). Нижнюю часть эритроцитарного столба, оставшуюся после первого центрифугирования, также ресуспендируют и подвергают фракционированию путем последовательного отбора и удаления верхней половины эритроцитарного столба, ресуспендирования и новых центрифугирований. Эту процедуру повторяют четыре раза. После четвертого удаления верхней половины эритроцитарного столба на дне пробирки остается 1 – 1,2 мл нижнего слоя (фракция старых клеток). Фракционирование контролируют подсчетом ретикулоцитов. Полученный при фракционировании эритроцитов верхний слой содержит 10-12% ретикулоцитов и более молодые эритроциты. Нижний слой содержит наиболее старые клетки. Ретикулоциты в ней отсутствуют. По окончании фракционирования фракции молодых и старых клеток и общую эритроцитарную массу отмывают от плазмы (рис. 5.2.1).  Рисунок – 5.2.1. Схема фракционирования эритроцитов Определение гематокрита Гематокрит – это показатель, характеризующий соотношение форменных элементов и плазмы крови. Определяется с помощью центрифугирования цельной крови в капилляре в специальной центрифуге. Для определения гематокрита производят забор крови в специальный капилляр для определения гематокрита. Капилляр обязательно должен быть обработан антикоагулянтом – гепарином или раствором цитрата натрия. При заполнении капилляра в него не должны попадать пузырьки воздуха. Заполненный капилляр помещают в центрифугу и центрифугируют 1 мин. при 7000 об/мин (5478g). После полной остановки центрифуги капилляр достают и измеряют высоту всего столбика крови и высоту, занимаемую форменными элементами. Рассчитывают гематокрит как процент форменных элементов от всего объема крови. Полученные данные необходимо сравнить с показателями нормы гематокрита для здорового человека: 43% для женщин, 45% - для мужчин. Такое состояние носит название нормоцитемии. Если относительный объем форменных элементов составляет менее 45%, то это носит название олигоцитемии, а если более 45%, то полицитемии. Подсчет ретикулоцитов Для подсчета ретикулоцитов на стекла шлифовальным предметным стеклом наносили мазок краски (1,2%-ный раствор бриллиант крезилового синего, приготовленный на абсолютном спирте). На край окрашенного стекла помещали каплю суспензии эритроцитов нужной фракции и делали мазок. Полученные мазки немедленно помещали во влажную камеру на 10-15 минут. По окончании окрашивания стекла высушивали и осуществляли подсчет ретикулоцитов под микроскопом. В отличие от равномерной зеленовато-голубой окраски эритроцитов ретикулоциты имеют характерную фиолетово-синюю зернистость. Подсчет ретикулоцитов производят на 3000 клеток. Количество ретикулоцитов выражают в процентах. Определение содержания гемоглобина Содержание гемоглобина (Hb) определяют унифицированным гемиглобинцианидным методом с использованием набора реактивов фирмы «Агат-Мед». Принцип метода заключается в следующем: Hb крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в Met-Hb, образующий с ацетонциангидрином гемиглобинцианид (цианметгемоглобин), оптическая плотность которого при 540 нм пропорциональна концентрации Hb в образце крови (Меньшиков, 1987). Содержание Hb в опытных образцах выражали в граммах на литр упакованных эритроцитов. Реактивы: 1. Трансформирующий реагент – сухая смесь (натрий углекислый кислый, 1,0 г; калий железосинеродистый, 200 мг). 2. Ацетонциангидрин. 3. Калибровочный раствор гемоглобина с концентрацией 120 г/л. Оборудование: спектрофотометр или фотоколориметр. Ход определения: к 5 мл трансформирующего раствора добавляют 0,02 мл крови (разведение в 251 раз) или гемолизата (разведением не более чем в 10 раз), хорошо перемешивают. Определение проводят через 10 минут против холостой пробы (трансформирующего раствора), окраска устойчива в течение не менее 1 часа. При использовании спектрофотометра определение оптической плотности проводят при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Содержание гемоглобина рассчитывают по формуле:   .При использовании фотоколориметра определение проводят в диапазоне длин волн 500-560 нм (зелёный светофильтр). Калибровочный раствор гемоглобина обрабатывают так же, как и пробу цельной крови. Расчёт содержания гемоглобина производят по формуле:  , гдеHb – содержание гемоглобина в опытной пробе, г/л; Dо – оптическая плотность опытной пробы; Dx – оптическая плотность калибровочной пробы; 120 – содержание гемоглобина в калибровочном растворе, г/л. 5.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК КРОВИ В КАМЕРЕ ГОРЯЕВА Знакомство с устройством камеры Горяева Камера Горяева представляет собой специальное устройство для подсчета форменных элементов крови. На ее поверхности нанесена сетка, разделяющая пространство на квадраты: большие и маленькие (рис. 5.3.1).  a – маленький квадрат, б – большой квадрат Рисунок – 5.3.1. Камера Горяева: А – вид сверху; В – вид сбоку; В – сетка; К поверхности камеры притирается покровное стекло. Притирание осуществляется осторожно по краям покровного стекла до появления радужных колец. Полученный объем между камерой и покровным стеклом служит для заполнения разведенной кровью или же приготовленной по конкретной методике смесью клеток и среды. Чаще всего считают количество клеток в 80-ти маленьких квадратах (5-ти больших квадратах). Объем над каждым квадратом камеры имеет строго определенный объём. Расчёт определённого объёма камеры производится с учётом следующих данных (см. рис. 1): Размер одной стороны маленького квадрата = 1/20мм; Площадь маленького квадрата = 1/20 * 1/20 = 1/400мм2; Высота камеры = 1/10мм; Объём маленького квадрата = 1/400 * 1/10 = 1/4000 мм3 = 0,00025мм3; Объём большого квадрата = 0,00025мм3 * 16 = 0,004мм3; Объём 5-ти больших квадратов = 0,004мм3 * 5 = 0,02мм3 = 0,02мкл = 0,02 * 10-3 мл смеси; Во избежание двукратного подсчета клеток, находящихся на линиях сетки пользуются правилом буквы «Г»: относящимися к данному квадрату считаются клетки, лежащие внутри квадрата и на левой и верхней границе. Клетки, пересекающие правую и нижнюю границу не подсчитываются. Определение количества эритроцитов крови в камере Горяева Принцип метода состоит в подсчете эритроцитов в камере Горяева. Для уменьшения концентрации форменных элементов и создания удобной для подсчета их концентрации кровь предварительно разводится стандартным образом. Материалы и оборудование:5%-ный раствор цитрата натрия; 3,5% раствор NaCl, пипетка на объем не менее 5 мл, капилляр Сали, покровное стекло, камера Горяева. Ход работы: пипеткой отмеряют 4 мл разводящего раствора (3,5% раствор NaCl) и выливают в сухую пробирку. Капилляр Сали обрабатывается раствором цитрата натрия. Из прокола пальца выпускают свежую каплю крови, приставляют к ней кончик капилляра Сали и наполняют его до отметки 0,02. Это соответствует объему 0, 02 мл или 20 мкл. Вытирают кончик капилляра и выпускают кровь в пробирку с разводящим раствором. Полученное таким образом разведение крови - 1:200. После тщательного перемешивания раствора крови небольшой каплей заполняют подготовленную (с притертым стеклом) камеру Горяева. Капля должна заполнить камеру самотеком. Камеру помещают под микроскоп и приступают к подсчету. Считать эритроциты удобно при маленьком увеличении (окуляр 10х, объектив 7х). Подсчет эритроцитов производится в 80 маленьких квадратах камеры - 5 больших, состоящих из 16 маленьких. Большие квадраты для подсчета необходимо выбирать по диагонали камеры. Для записи результатов рекомендуется предварительно расчертить на листе 5 больших квадратов, разлинованных 4х4 и записывать найденное число эритроцитов в каждую клеточку. При подсчете необходимо помнить правило буквы «Г». Подсчитав число эритроцитов в 80 маленьких квадратах (N) рассчитывают число клеток в 1 мкл крови (X). Для этого учитывается разведение в 200 раз, объем камеры над одним маленьким квадратиком 1/4000 мкл и то, что клетки подсчитывались в 80 таких квадратах. Таким образом формула для вычисления количества эритроцитов следующая: Х=(Nх4000х200)/80 Полученное количество эритроцитов можно также выразить в количестве на 1л крови, что является стандартной размерностью этого показателя. Выводы делаются из сравнения полученного числа с нормой для этого показателя: 3,6-4,5 х 1012 кл/л для женщин; 4,5 - 5 х 1012 кл/л - для мужчин. Если количество эритроцитов выше нормы, то это явление называется эритроцитоз, а если меньше, то эритропения или анемия. Определение количества лейкоцитов крови Определение количества лейкоцитов так же как и эритроцитов осуществляется в камере Горяева. Разведение крови производят в 20 раз 3-5% уксусной кислотой. При этом эритроциты разрушаются и не мешают счету. Материалы и оборудование: 3-5% раствор уксусной кислоты с добавлением метиленового синего, 5% раствор цитрата натрия, пипетка объёмом на 1 мл, капилляр Сали, покровное стекло, камера Горяева. Ход работы: пипеткой отмеряют 0,4 мл разводящего раствора (3-5% раствора уксусной кислоты), подкрашенной метиленовым синим и переносят в чистую пробирку. Кровь забирают в капилляр Сали, наполняя его самотеком до метки (0,02). Кончик капилляра вытирают и переносят кровь в пробирку с разводящим раствором. Получают разведение 1:20. Подсчет количества лейкоцитов производят в 5 больших квадратах камеры Горяева. Расчет количества лейкоцитов в 1 мкл крови (Х) производят с учетом разведения, объема камеры и числа подсчитанных клеток в 80 маленьких квадратах (N): Х=(Nх4000х20)/80 Полученное количество лейкоцитов обычно выражают в количестве на 1л крови. Выводы делаются из сравнения полученного числа с нормой для этого показателя: в норме у взрослого человека содержание лейкоцитов в крови составляет 4-9 х 109 кл/л. Увеличение количества лейкоцитов в крови называется лейкоцитозом, а уменьшение – лейкопенией. Выделение лимфоидной фракции клеток из крови и подсчёт лимфоцитов в камере Горяева Для выделения фракции мононуклеарных клеток из крови проводят разделение клеток в градиенте фиколл-верографина. Плотность раствора для лимфоидных клеток экспериментальных животных и для человеческих лимфоцитов различна. Материалы и оборудование: 1. Кровь с антикоагулянтом (гепарин или ЭДТА). 2. Фиколл-верографин плотностью для лимфоцитов человека или животных; 3. Отмывающий раствор для лимфоцитов. Для отмывания лимфоцитов может быть использован любой из следующих растворов: стерильная среда 199, RPMI 1640, среда Хенкса или физиологический раствор (0,9% NaCl). Для последнего разведения используют среду 199 или же среду Хенкса. 4. Стерильная стеклянная посуда (центрифужные пробирки на 10 мл, пипетки на 2-10 мл, пастерки) 5. Резиновая груша; 6. Камера Горяева; 7. Центрифуга; 8. Световой микроскоп; Ход работы: 1. В центрифужные пробирки налить по 2 мл смеси фиколл-верографина. 2. Весь объём крови осторожно по внутренней стенке пробирки пастеркой с грушей наслоить на смесь фиколл-верографина. Если объём крови больше чем 6 мл, то необходимо брать больший объём смеси фиколл-верографина. 3. Кровь центрифугируют в течение 40 мин при комнатной температуре при 1500 об/мин (430g). 4. После центрифугирования в пробирке видно 4 фракции (рис. 5.3.2): первая фракция на дне пробирки – эритроциты и гранулоциты; вторая фракция – раствор фиколл-верографина с примесью клеток; третья фракция - мононуклеарные клетки; четвёртая фракция – плазма крови с тромбоцитами.   Рисунок – 5.3.2. Разделение крови на фиколл-верографине; а – до центрифугирования; б – после центрифугирования 5. Осторожно подводят кончик пастерки к слою мононуклеарных клеток и с помощью резиновой груши клетки отбирают круговыми движениями. Эту манипуляцию можно проделать с помощью автоматической пипетки. Отобранные клетки переносят в центрифужную пробирку. 6. Собранные лимфоциты отмывают любым из перечисленных выше растворов. Для этого к собранным клеткам добавить ≈10 мл отмывающего раствора и центрифугировать 10 минут при 3000 об/мин (1700g). Надосадочную жидкость слить. Для того чтобы лимфоциты отстали от стенок и дна пробирки её нужно хорошо встряхнуть. 7. После этого вновь добавить 5 мл отмывающего раствора и центрифугировать в течение 5 минут при 3000 об/мин (1700g). Надосадочную жидкость слить. Этот этап повторить дважды. 8. Лимфоциты встряхнуть и развести средой, для этого добавить ≈ 0,5 мл среды. Хорошо перемешать содержимое пробирки и этой смесью заполнить камеру Горяева. 9. Подсчитать количество лимфоцитов в 5 больших квадратах. Для этого используем расчет объёма смеси в 5-ти больших квадратов (см. рис. 5.3.1.1): Размер одной стороны маленького квадрата = 1/20мм; Площадь маленького квадрата = 1/20 * 1/20 = 1/400мм2; Высота камеры = 1/10мм; Объём маленького квадрата = 1/400 * 1/10 = 1/4000 мм3 = 0,00025мм3; Объём большого квадрата = 0,00025мм3 * 16 = 0,004мм3; Объём 5-ти больших квадратов = 0,004мм3 * 5 = 0,02мм3 = 0,02мкл = 0,02 * 10-3 мл смеси; 1. Для расчёта количества клеток в 1 мл исследуемой смеси составляем пропорцию (см. раздел 8):
|