Clostridium novyi
Clostridium novyi (Clstridium oedematiens типа А) — как и Clostridium perfringes – основной возбудитель анаэробной раневой инфекции, также известной как газовая гангрена, газовый или злокачественный отек, инфекционного некротического гепатита овец. Впервые раневая госпитальная гангрена была описана Паре в 1562 г, через 3 столетия Вельпо (1839) опубликовал свои наблюдения над подобным заболеванием, названным им «травматическая эмфизема». Полное описание клинической картины и течения разлитых форм газовой инфекции, наблюдаемых им во время Севастопольской и Кавказской кампаний, дал Н.И. Пирогов. Позднее Веинберг и Сэган (1891) установили, что открытая ими бацилла злокачественного отека (Clostridium oedematiens типа А) способна вызывать инфекции у человека; возбудитель позднее (1894) был охарактеризован Нови и получил его имя. В годы второй мировой войны инфекции, вызванные Clostridium novyi, составляли 42% случаев гангрены. Микроорганизм широко распространен в природе, может быть выделен из почвы, осадочных отложений, а также из органов ЖКТ здоровых животных.
Морфология и культуральные свойства
Вегетативные клетки. Крупные или слегка изогнутые подвижные грамположительные палочки размером 4-101-2мкм; перитрихи (20-25 жгутиков). Обладают выраженным полиморфизмом (некоторые штаммы образуют короткие цепочки или нити); при старении теряют способность окрашиваться по Грaму, но хорошо красятся анилиновыми красителями. В молодых культурах похожи на Clostridium perfringens, но отличаются подвижностью. Облигатный анаэроб (при пересевах колонии, выросшие на поверхности питательных сред, следует как можно меньше держать на воздухе). Молодые клетки хорошо окрашиваются основными анилиновыми красителями, бактерии из старых культур могут изменять отношение к окраске по Граму.
Споры овальные, расположены центрально или субтерминально. На мясных и казеиновых средах спорообразование наблюдают на 2-6 сутки. Лучше всего споры образуются на средах, бедных утилизируемыми углеводами и другими питательными веществами. На обогащенных средах спорообразование менее обильное и более медленное. Устойчивы к нагреванию (выживают при кипячении в течение 1-2 ч), в костях животных сохраняются до 10 лет.
Морфология колоний. На плотных средах в анаэростате уже через 48 ч образуют круглые сочные сероватые полупрозрачные колонии, иногда с зернистой поверхностью и неровными краями. Различают несколько типов бактерий. Бактерии типов А, В и С имеют тенденцию к образованию дочерних и подвижных колоний. На кровяном агаре возбудитель склонен образовывать шероховатые колонии, у бактерий типов А, В и С они окружены зоной гемолиза. Бактерии типа D эритроциты не разрушают. Колонии типов А и В, выросшие на кровяном агаре с бензидином, быстро чернеют на воздухе (за счет образования Н2О2). В глубине агара образуются колонии, напоминающие линзы, комочки ваты, снежные хлопья и т. д., часто окрашены в желтоватый или коричневатый цвет. На жидких средах колонии растут сравнительно медленно и вызывают сдвиг рН в кислую сторону (за счет образования органических кислот и Н2S). На мясо-пептонных бульонах с 0,5% глюкозы или 3% декстрина при 37°С происходит равномерное помутнение среды, затем образуется рыхлый осадок.
Антигенная структура
Серологическая идентификация основана на выявлении соматических Аг; у штаммов типов А, В и D антигенная структура представлена 2 одинаковыми соматическими Аг, находящимися в различных соотношениях, антисыворотки к штаммам типа В могут иногда перекрестно реагировать с Аг других типов.
Биохимические свойства
Бактерии типов А, В и С ферментируют глюкозу, фруктозу и мальтозу, а тип D — только глюкозу, глицерин разлагают все микроорганизмы (кроме нескольких штаммов типа В). Показано наличие у бактерий типа А глицерокиназы, α-амилазы и α-глюкозидазы, что указывает на способность разлагать полисахариды путем гидролиза и фосфорилирования. Протеолитические свойства у Clostridium novyi выражены сравнительно слабо, все штаммы разлагают желатин, свертывают молоко (медленно), но не разлагают свернувшийся яичный белок (исключая несколько штаммов), бактерии типа D образуют индол и H2S.
Патогенность
Clostridium novyi типов А и В вызывают газовую гангрену у человека и животных (наиболее частый возбудитель — тип А). Бактерии вырабатывают 8 токсинов, определяющих их патогенность (табл. 6). -токсин (фосфолипаза) и -токсин (некротическая, гемолитическая лецитиназа С) не тождественны одноименным токсинам Clostridium perfringens. -токсин – термолабильный, некротизирующий токсин (его продуцируют культуры типа А и В), кроме того, Clostridium novyi образует гиалуронидазу, идентичную -токсину С. perfringens. Культуры патогенны для многих лабораторных животных (мыши, морские свинки, кролики, крысы). У морских свинок на месте инъекции образуется желатинозный, студенистый отек. У 50% штаммов культуральная жидкость токсична для мышей.
Лабораторная диагностика
Лабораторная диагностика включает серологическую идентификацию Аг возбудителя и AT к ним в различных биологических жидкостях организма и выделение культуры возбудителя (аналогично бактериологическому исследованию на наличие Clostridium perfringens), что в случае Clostridium novyi представляет определенные трудности. Дифференциальную диагностику от прочих клостридий, вызывающих анаэробные инфекции, проводят оценкой сахаролитических, протеолитических и некоторых других биохимических свойств (табл. 7).
Таблица 6. Токсины, вырабатываемые различными типами Clostridium novyi
Токсин
|
Биологическая активность
|
Тип А
|
Тип В
|
Тип С
|
Тип D
|
|
Термолабильный, летальный, некротический
|
+
|
+
|
–
|
–
|
|
Лецитиназа С, летальный, некротический, гемолитический
|
–
|
+
|
–
|
+
|
|
Лецитиназа, некротический, гемолитический
|
+
|
–
|
+(?)
|
–
|
|
О2-лабильный, гемолизин
|
+
|
–
|
–
|
–
|
|
Липаза
|
+
|
–
|
–
|
–
|
|
Гемолизин, О2-стабильный
|
?
|
+
|
–
|
–
|
|
Тропомиозиназа
|
–
|
+
|
–
|
+
|
|
Активность неизвестна, вызывает помутнение лецитовителлина
|
–
|
+
|
–
|
+
|
|
Вызываемые заболевания
|
Анаэробная инфекция
|
Анаэробная инфекция, «черная болезнь» травоядных
|
Хронический остеомиелит буйволов
|
Бациллярная гемоглобинурия телят
|
Таблица 7. Признаки некоторых патогенных клостридий
Признак
|
С. perfringens
|
С. novyi
|
С. septicum
|
С. hislolyticum
|
С. sporogenes
|
С. bifermentans
|
С. sordellii
|
C.fallax
|
Подвижность
|
–
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
Сахаролитические свойства:
|
глюкоза
|
+
|
+
|
+
|
±
|
+
|
+
|
+
|
+
|
левулеза
|
+
|
±
|
+
|
±
|
–
|
–
|
+
|
+
|
лактоза
|
+
|
±
|
+
|
±
|
–
|
–
|
–
|
±
|
сахароза
|
+
|
±
|
±
|
±
|
–
|
–
|
+
|
+
|
галактоза
|
+
|
±
|
+
|
±
|
+
|
–
|
–
|
±
|
мальтоза
|
+
|
±
|
+
|
±
|
+
|
–
|
+
|
+
|
инулин
|
–
|
–
|
–
|
±
|
–
|
–
|
–
|
±
|
маннит
|
±
|
±
|
±
|
±
|
–
|
–
|
±
|
–
|
дульцит
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
салицин
|
–
|
±
|
+
|
±
|
–
|
+
|
–
|
±
|
глицерин
|
±
|
+
|
±
|
±
|
–
|
–
|
+
|
–
|
крахмал
|
+
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
Свернувшаяся сыворотка
|
±
|
–
|
–
|
+
|
+
|
+
|
+
|
–
|
Гемолитическая активность
|
±
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
±
|
Лакмусовое молоко
|
КГ, сгусток через 3-16 ч
|
Свертывание за несколько сут
|
То же
|
Пептонизация
|
То же
|
То же
|
То же
|
Медленная пептонизация
|
Агар с бензидином
|
–
|
Почернение
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
|
КГ — ферментация с образованием кислоты и газа.
Прочие возбудители анаэробной раневой инфекции
Помимо Clostridium perfrigens и Clostridium novyi, патологические процессы у человека и животных могут вызывать и другие клостридии. Исторически многообразие форм анаэробных поражений привело к тому, что к началу первой мировой войны имелось 71 наименование, обозначающее анаэробную инфекцию, за время войны их дополнили 20 названиями, а к концу войны — еще 16. В 1861 г. Пастер описал «септический вибрион», а со времени выделения культуры совместно с Жубером (1977) Vibrion septique длительное время оставался единственным идентифицированным патогенным микробом, с действием которого связывали многие заболевания. Дальнейшая история открытия возбудителей анаэробных инфекций включает выделение сапрофитов С.pulrificus (Биншток, 1883) и Clostridium sporogenes (И. И. Мечников, 1908), а в 1915 г. Вейнберг и Сэгэн выделяют C.fallax, «бациллу злокачественного отека» Clostridium oedematiens (1915) и «тканерасплавляющую» бациллу Clostridium histolyticum (1917). Характерная особенность микроорганизмов — способность проявлять патогенное свойство в условиях смешанных раневых инфекций. Все они грамположительные анаэробы (но некоторые относительно толерантны к O2), образуют споры, форма которых варьирует от круглой до цилиндрической. Принцип выделения возбудителей напоминает таковой при выделении культуры С. perfringens.
Clostridium histolyticum
Подвижная палочка (также встречаются неподвижные изоляты) размером 3-50,5-0,8 мкм; грамположительна, но в старых культурах может быть грамотрицательной. В мазках часто образует пары или короткие цепочки, иногода единичные бактерии. Очень подвижна в молодых культурах, клетки из старых культур неподвижны (также известны изначально неподвижные штаммы). Почти на всех средах быстро образует субтерминальные споры («игольное ушко») с трехслойной оболочкой, не деформирующие клетку. Строгий анаэроб, растет при давлении 3-15 мм рт.ст. (оптимум 8 мм рт.ст.), но обладает аэротолерантностью, оставаясь жизнеспособной в аэробных условиях в течение 10 ч. В аэробных условиях растет плохо и не образует спор и образует колонии меньшего размера. В анаэробных условиях на кровяном агаре образует прозрачные выпуклые колонии диаметром 0,5-1 мм, окруженные тонкой зоной гемолиза. При продолжительном отборе можно получить штаммы, формирующие колонии в виде головы Медузы. В толще агара неподвижные штаммы образуют «пушинки» с уплотненным центром, подвижные — чечевицеобразные колонии или колонии с протуберанцем. Вызывают сплошное помутнение жидких сред с протеолизом кусочков мяса и печени на дне. Через 2 сут среда становится прозрачной, а на дне образуется осадок. рН почти не меняется; запах отсутствует. Инертны к углеводам (к ферментации без образования кислоты способны лишь некоторые штаммы); не образуют индол, но вырабатывают в больших количествах сероводород. Проявляют выраженные протеолитические свойства — разлагают желатин, свернувшуюся сыворотку, яичный белок и коллаген (табл. 7). Продуцируют 5 серологически идентифицируемых токсинов: -токсин (основной токсин), оказывающий летальное и некротическое действие; -токсин (коллагеназа), расщепляющий азоколл и желатин; -токсин (протеиназа), активируемый восстановителями и не разрушающий нативный коллаген, но расщепляющий азоколл, желатин и казеин; -токсин (эластаза), проявляющий аналогичную активность; -токсин, проявляющий О2-зависимую гемолитическую активность (лабилен к кислороду, в антигенном отношении близок к стрептолизину О). У животных Clostridium histolyticum – один из возбудителей злокачественного отека (газовой гангрены), обычно в ассоциации с прочими анаэробами. Clostridium histolyticum патогенны для лабораторных животных. Морские свинки при внутримышечной иньекции свежей вирулентной культуры, выращеной на мясной среде, погибают в период от нескольких часов до нескольких дней. В зоне инъекции наблюдается расплавление мышц, газа не образуется, гнилостного распада нет.
В соответствии с действующей инструкцией при лабораторной диагностике злокачественного отека проводится микрокопическое исследование, подкожное заражение морских свинок изучаемым материалом в область брюшных мышц, изучение тинкториальных и культуральных свойств выделенной культуры.
Clostridium septicum (палочка Гона-Сакса)
Возбудитель злокачественного отека, брадзота овец. Обнаруживается в почве, кишечном тракте домашних животных, при соответствующей патологии животных и человека. Полиморфные подвижные палочки размером 4-50,8 мкм; в тканях способны образовывать нити длиной до 500 мкм. В культурах клетки могут быть яйцевидные, веретеновидные, образуют цепочки. При контакте с О2 теряют подвижность, но не так быстро, как С. oedematiens. Через 24 ч культивирования образуют субтерминальные споры. Строгие анаэробы; растут при давлении 8-15 мм рт.ст. (выдерживают до 25 мм рт.ст.). Остаются жизнеспособными при доступе О2 в течение 10 ч. На поверхности твердых сред образуют блестящие полупрозрачные колонии (диаметром до 4 мм) с неровными краями (имеют тенденцию к ползучему росту). На агаре Цейсслера через 48 ч палочки образуют сплошной нежный налет, окруженный зоной гемолиза. В столбике 1% агара формируют колонии с отходящими переплетающимися нитями, на 2% агаре колонии имеют вид дисков, иногда с протуберанцем. Ферментируют некоторые углеводы и не разлагают (практически все штаммы) сахарозу (что используют для дифференциальной диагностики с С.chavoei); протеолитическая активность выражена умеренно (см. табл. 7). На среде Китта-Тароцци дает обильный рост; газообразование вариабельное; через 2 суток образует осадок. Продуцируется 4 экзотоксина: -токсин, основной фактор патогенности, проявляющий летальную, некротизирующую и гемолитическую активность; -токсин, обладающий свойствами ДНКазы; -токсин (гиалуронидаза); -токсин, проявляющий свойства О2-лабильного гемолизина. При дифференциации от Clostridium chavoei используют следующие тесты: гемагглютинация эритроцитов барана, гемолиз эритроцитов курицы (Матвеев, Быченко 1973).
Clostridium chavoei
Возбудитель эмфизиматозного карбункула крупного рогатого скота и овец. Бактериальные клетки отличаются полиморфизмом, особенно в живой ткани, могут иметь форму лимона, груши, в мазках чистой культуры - прямые или слегка изогнутые палочки, одиночные, пары, реже короткие цепочки. По своим биологическим и антигенным свойствам мало отличается от Clostridium septicum, некоторые авторы рассматривают его как подвид С.septicum: С.septicum тип А и С. chavoei тип В. Однако каждый из этих микроорганизмов полностью нейтрализует только гомологичная сыворотка, а при дифференциальной диагностике этих микроорганизмов необходимо учитывать отсутствие полной перекрестной нейтрализации токсинов, слабую терморезистентность у С. septicum и высокую у С. chavoei, длительный инкубационный период при инфекции, вызванной первым микроорганизмом, и практически полное его отсутствие при заболеваниях, вызванных С. chavoei, способность С. septicum агглютинировать эритроциты барана и лизировать эритроциты кур. Молоко створаживает за 3-6 суток; казеин и свернувшуюся сыворотку не разжижает; желатин не гидролизует. На кровяном агаре, среде Цейсслера образует характерные слабо выпуклые колонии в виде перламутровой пуговицы или с изрезанными краями – напоминающие виноградные листья, нежного фиолетового цвета; на средах с кровью дает -гемолиз. На среде Китта-Тароцци характерен обильный рост, споры образует через 24 ч, колонии не имеют неприятного запаха, но старые культуры могут иметь запах прогорклого масла. Строгий анаэроб. Температурный оптимум 36-37°С. Слабо растет при 25°С и не растет при 45°С. В соответствии с методическими указаниями по диагностике эмкара, исследования включают изучение тинкториальных и культуральных свойств выделенного микроорганизма (без изучения биохимических свойств) и определение ее патогенности для морской свинки. Характерным изменением у морских свинок, зараженных подкожно в области брюшных мышц является наличие гемморагического выпота или точечных кровоизлияний на месте инъекции. Кожа от пораженных мышц отделяется с трудом, мышцы темно–красного цвета. В подкожной клетчатке обнаруживают небольшое количество пузырьков газа.
Clostridium sporogenes
Ассоциируется с возбудителем злокачественного отека. Выделяется из почвы, фекалий овец, собак и при патологических состояниях человека и животных. Подвижные палочки размером 3-60,5 мкм; проявляют выраженныные протеолитические свойства и биохимически инертны в отношении большинства углеводов (табл. 7). Температурный оптимум 30 – 40°С. Анаэроб. На кровяном агаре формирует колонии неправельной формы с ризоидными краями, серого цвета, выпуклые, обычно с зоной гемолиза. В агаре столбиком рост напоминает комочки ваты с плотным центром. При смешанных анаэробных инфекциях увеличивают вирулентность Clostridium perfringens и Clostridium septicum; при попадании жизнеспособных спор в мышцы способны вызывать гнойные процессы. Палочка не образует токсинов, участвующих в патогенезе анаэробной раневой инфекции.
Clostridium sordellii
Выделена Сорделли от больного газовой гангреной в Буэнос-Айресе; (1922). Один из возбудителей злокачественного отека. Обнаруживают в почве и при патологических состояниях человека и животных. Подвижная палочка размером 2-40,6-1 мкм; факультативный анаэроб; на плотных питательных средах уже через 24-48 ч образует выпуклые сероватые колонии с неровными краями. На агаре с эритроцитами лошади дает узкую зону гемолиза, а на шоколадном агаре образует узкую зону просветления (за счет протеолиза). На агаре с куриным желтком, молоком и лактозой формирует зону опалесценции вокруг колоний. На жидких мясных средах дает интенсивный рост, часто с образованием слизи. Ферментирует многие углеводы, но не лактозу и сахарозу, проявляет выраженные протеолитические свойства (табл. 7). Вирулентные штаммы продуцируют высоколетальный некротизирующий токсин, напоминающий -токсин Clostridium novyi; также образует лецитиназу С, серологически сходную с лецитиназой С. perfringens типа А, но проявляющую меньшую активность; продуцирует гемолизин типа -токсина С. perfringens типа А и -токсина Clostridium novyi и Clostridium septicum.
Clostridium fallax
Впервые выделена Прево из почвы тропических районов Африки. Один из возбудителей газовой гангрены. Подвижная прямая палочка (в молодых культурах) с закругленными концами, 2-50,5 мкм; строгий анаэроб, температурный оптимум 37°С; на поверхности агара через 24-48 ч образует мелкие плоские прозрачные колонии с неровными краями, по мере старения колонии становятся матовыми; в агаре с высоким столбиком образует чечевицеобразные колонии, на кровяном агаре дает узкую полоску гемолиза. Ферментирует углеводы; проявляет умеренную протеолитическую активность (табл. 7), свертывает молоко с образованием кислоты. Не образует индола и не восстанавливает нитраты. По мнению ряда авторов, способна вырабатывать летальный токсин, серологически не идентифицированный до настоящего времени. Свежевыделенные штаммы вирулентны для морских свинок и мышей, вызывают серозно- фибринозный отек и некроз мышц. При пассаже вирулентность штаммов быстро теряется.
Clostridium bifermentans
По морфологии и биохимическим свойствам похожа на Clostridium sordellii, дифференциальная диагностика основана на серологической идентификации агглютининов спор; образует лецитиназу С. Иногда вызывает газовую гангрену у человека; вместе с Clostridium novyi, С.septicum, С.histolyticum и С.perfringens типа А (продуцирующими -токсин) относится к так называемым гистотоксическим клостридиям. Неподвижная палочка размером 4-81-1,5 мкм, в молодом возрасте грамположительная; в мазках располагается цепочками. Быстро образует центральные или субтерминальные споры, не деформирующие клетку. На агаре Цейсслера обусловливает нежный рост, напоминающий рост С. oedematiens. На средах с кровью дает -гемолиз; проявляет лецитиназную активность (лецитиназа С). Разжижает свернувшуюся сыворотку, гидролизует желатин, ферментирует глюкозу, левулезу и мальтозу. На среде Китта-Тароцци газ не образуется, через 24 ч культивирования появляется осадок. Рост сопровождается гнилостным запахом.
Clostridium difficile
Среди прочих патогенных клостридий следует упомянуть открытую Холлом и О'Тулом (1935) Clostridium difficile. Возбудитель вызывает псевдомембранозный энтероколит на фоне нерациональной терапии антибиотиками (клиндамицином, ампициллином и цефалоспоринами) и цитостатиками, вызывающими глубокий дисбаланс микрофлоры и колонизацию кишечника С.difficile. Бактерии продуцируют 2 вида экзотоксина — токсин А (энтеротоксин) с Mr 44 000-50 000 Д (оказывает диареегенное и летальное действие, стимулирует гуанилатциклазу) и токсин В (цитотоксин) с Mr 47 000 Д (оказывает летальное действие, значительно превосходящее действие токсина А, нарушает функции мембран с потерей К+ и фибронектина, ингибирует синтез белка). Проявляет высокую резистентность к антибиотикам широкого спектра действия, что создает предпосылки для обширной колонизации кишечника и секреции больших доз токсинов, вызывающих изменения кишечной стенки; чувствительна к действию ванкомицина. Носительство С. difficile особенно распространено у новорожденных (до 50%), но именно у них наблюдают самый низкий уровень поражений. По мере развития нормальной микрофлоры (6-12 месяцев) число носителей уменьшается и среди взрослых лиц не превышает 3%. Следует помнить, что псевдомембранозный колит — сугубо госпитальная инфекция, доминирующая среди прочих госпитальных кишечных поражений, превышая в 2-3 раза число инфекций, вызванных сальмонеллами. Среди новорожденных возможна контактная передача от ребенка ребенку или с руками персонала (при пеленании, кормлении и купании одними и теми же руками); среди взрослых доминируют контактно-бытовые пути госпитального распространения.
Антибиотиковый энтероколит характеризуется профузными водянистыми диареями; у 50% пациентов выявляют лейкоциты в кале и лейкоцитоз. Больные жалуются на коликообразные боли в животе, температура тела может достигать 39°С и выше.
Псевдомембранозный энтероколит характеризуется образованием и выделением с калом пленчатого материала — структур, представленных фибрином и слизью.
Питательные среды для культивирования клостридий
Среда Китта-Тароцци. Мясо или печень крупного рогатого скота нарезают мелкими кусочками, заливают трехкратным объемом МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,4—7,6) и 30 минут кипятят. Затем среду фильтруют, печень (мясо) промывают водопроводной водой, подсушивают фильтровальной бумагой. По 3—4 кусочка мяса (печени) помещают в пробирку, наливают 7—8 мл бульона, покрывают слоем вазелинового масла и стерилизуют при 120°С 20 минут. Перед использованием среду регенерируют (кипятят с последующим охлаждением).
Кровяной агар с глюкозой. К 3%-ному МПА (рН 7,2—7,4), расплавленному и охлажденному до 50°С, добавляют до 1—2% стерильного раствора глюкозы, 15—20% свежей дефибринированной крови барана или лошади. Разливают по чашкам Петри, подсушивают 20—30 минут в термостате. Культивирование проводят в анаэростате.
Полужидкий агар для строгих анаэробов (Тароцци). В бульон Мартена (рН 7,2-7,4) с 0,3-0,5% глюкозы добавляют 0,1% агара. Среду разливают по 9 мл в стерильные пробирки с кусочками вареного мяса, печени или фарша, стерилизуют при 120°С 30 минут. Среду можно использовать, не заливая поверхность вазелиновым маслом.
Агар для трубок Виньял-Вейона. В бульоне Мартена (рН 7,4) растворяют 2% агара, 0,1% глюкозы. Среду разливают в узкие тонкостенные пробирки и стерилизуют дробно, текучим паром в течение 3 дней.
Бульон Вейнберга для анаэробов. 1 кг бычьего сердца пропускают через мясорубку, добавляют к фаршу 1 л воды, нагревают до кипения, охлаждают, снимают жир. Смешивают 400 г печени, 400 г свиных желудков, 40 г соляной кислоты, 4 л воды, подогретой до 50°С, и выдерживают при этой температуре 18-24 ч. Затем подогревают до 100°С, жидкость сливают, фильтруют, добавляют 0,2% двуосновного фосфорнокислого натрия и устанавливают рН 7,4. Смешивают 1 л мясной воды из сердца быка и 2 л полученного пептона, устанавливают рН 7,8—8,2 и стерилизуют при 120°С 30 минут. Бульон разливают по пробиркам с кусочками вареной печени, наливают стерильное вазелиновое масло слоем 0,5 см и вновь стерилизуют при 120° С 30 минут. Перед посевом к бульону добавляют стерильный раствор глюкозы до 0,5%.
Среда Виллиса и Хоббе. Смешивают 400 мл бульона Хоттингера, 4,8 г агара, 4,8 г лактозы, 1,3 мл 1%-ного раствора нейтрального красного. Стерилизуют при 115°С 15 минут, охлаждают до 50°С и добавляют 15 мл стерильной желточной суспензии (смешивают поровну куриный желток и физиологический раствор) и 60 мл стерильного обезжиренного молока.
Железо-сульфитный агар (Вильсон, Блер, 1924). К 100 мл 3%-ного МПА (рН 7,4) с 1% глюкозы при температуре 60°С добавляют 10 мл 20%-ного раствора сернокислого натрия (Na2SO3) и 1 мл 8%-ного раствора хлористого железа (FeCl3), приготовленного на стерильной дистиллированной воде. Раствор Na2SO3 предварительно стерилизуют 1 ч текучим паром. Затем среду, не стерилизуя, разливают по чашкам Петри. Сернистокислый натрий можно заменить серноватистокислым натрием (Na2S2O3), а хлористое железо—сернокислым (FeSO4). При восстановлении Na2SO3 сульфат натрия соединяется с хлорным железом и образуется черный осадок сернистого железа (FeS). Этой способностью обладают анаэробы и некоторые аэробные бактерии, вследствие чего колонии таких микроорганизмов окрашиваются в черный цвет. С. perfringens, обладающий большой скоростью роста, изменяет цвет среды через 1-2 ч культивирования. Другие анаэробы формируют зеленовато-черные колонии через 6-7 ч.
Железо-сульфитное молоко (Робинзон, Стоваль, 1937). К 100 мл обезжиренного молока добавляют 10 мл 20%-ного раствора сернистокислого натрия и 1 мл 8%-ного хлористого железа. Среду готовят непосредственно перед использованием и разливают по пробиркам. На данной среде С. perfringens можно обнаружить в смеси со стрептококками, которые на других средах способны заметно тормозить его рост.
Бензидино-кровяной агар (Гордон, Мак Леод, 1940). К 3%-ному МПА (рН 6,4) с 1% глюкозы, подогретому до температуры 50°С, добавляют бензидин до концентрации 9% и 10% стерильной дефибринированной крови барана. Компоненты перемешивают до приобретения средой шоколадного оттенка, разливают по чашкам Петри и подсушивают 4-5 ч в термостате. Засеянные чашки выдерживают в анаэробных условиях в термостате 12-24 ч, а затем переносят в аэробные условия. Колонии С. novyi окрашиваются в черный цвет за 15-30 минут. Раствор бензидина готовят следующим образом: к 50 мл дистиллированной воды добавляют 0,25 г основного бензидина, 0,3 мл 1% HCl и нагревают до растворения. Раствор пригоден для употребления в течение 2 недель.
Желточно-кровяной агар (Шапина-Вегина, 1962). К 2,5%-ному МПА добавляют 10% дефибринированной крови барана, 10% желточной взвеси. Среда предназначена для выявления С. novyi. Через 16 ч выращивания колонии окружены непрозрачной зоной гемолиза с наличием на поверхности среды вокруг колоний непрозрачной пленки с жемчужным блеском. Другие бактерии (аэробы, анаэробы), как правило, не дают одновременно перламутрового слоя и зоны редукции.
Полусинтетическая среда (Bonnel, Burgian, Raby, 1959). Используют для культивирования и быстрой селекции анаэробных бактерий. В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 15 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 2,5 г натрия хлорида, 1,3 г агар-агара и подщелачивают Na2CO3. Смесь автоклавируют при 120° С в течение 15 минут, фильтруют и добавляют 5,5 г глюкозы, 0,5 г гидросульфита натрия (предварительно растворенные в небольшом количестве воды), устанавливают рН 7,1. Добавляют 0,001 г резазурина и встряхивают смесь в течение нескольких минут. Среду разливают в пробирки по 15 мл, стерилизуют при 110°С 30 минут, охлаждают под холодной водой. При росте анаэробов среда окрашивается в нижней части пробирки, факультативных анаэробов — весь столбик среды. Среду используют 3 недели при хранении в условиях комнатной температуры.
Перфрингенс-агар (O.P.S.P.-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 15 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г соевого пептона, 7 г печеночного экстракта, 1 г железа аммонийно-цитратного, 1 г натрия метабисульфита, 1,5 г трис-буфера, 10 г агара, устанавливают рН 7,3. Стерилизуют автоклавированием при 121 С 15 минут, затем охлаждают до 50°С, вносят добавки (стерильно), обеспечивающие среде селективные свойства, и разливают по чашкам Петри. Добавка «А» содержит 100 мл натрия судьфадиазина, добавка «В» — 0,5 г олеандомицина фосфата и 10000 ЕД полимиксина В сульфата. Среда состоит из 100 мкг/мл натрия сульфадиазина, 0,5 мкг/мл олеандомицина фосфата и 10 ЕД полимиксина В сульфата. Данный состав обеспечивает селективные свойства, оптимальные для изоляции С. perfringens.
Натрия метабисульфат и железо аммонийно-цитратное являются индикаторами редукции сульфита, что влияет на формирование колоний возбудителя черного цвета диаметром 2-4 мм. Рост других сульфатредуцирующих бактерий (сальмонеллы, протей, цитробактер, стафилококки, бациллы) ингибируется. На среде могут расти энтерококки, но их колонии по внешнему виду отличаются от колоний С. perfringens.
Анаэробный агар Шадпера (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптического соевого бульона, 5 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г декстрозы, 0,4 г цистеина гидрохлорида, 0,01 г гемина, 0,75 г трис-буфера, 13,5 г агара. Устанавливают рН 7,6, стерилизуют автоклавированием при 121°С 15 минут.
С селективными добавками среду используют для выделения клостридий, бактероидов, флавобактерий, лактобацилл, стрептококков (анаэробных) из проб фекалий и кишечного тракта.
Для изоляции клостридий и бактероидов к 1000 мл основного анаэробного агара добавляют 10 г порошка плаценты и 0,002 г неомицина. С целью выделения флавобактерий в 1000 м3 вносят 7 мл 0,5%-ного тиротрицина в этаноле. Для анаэробных лактобацилл и стрептококков в 1000 мл вносят 10 г натрия хлорида и 0,002 г неомицина. Посевы инкубируют при 37°С в анаэробных условиях.
Основной перфрингенс-агар (пропись фирмы «Дифко», 1982). Среда используется для изготовления TSC- или SFP-агара при предварительной идентификации и подсчете С. perfringens.
В 1000 мл дистиллированной воды растворяют триптозы—15 г, соевого пептона — 5 г, мясного экстракта (сухого) — 5 г, дрожжевого экстракта — 5 г, натрия метабисульфита — 1 г, железа аммонийно-цитратного — 1 г, агара — 14 г. Устанавливают рН 7,6, стерилизуют при 121°С 10 минут. Затем среду охлаждают до 50°С и вносят соответствующие селективные добавки.
Триптозо-сульфитный циклосериновый агар (TSC-агар). В основной перфрингенс-агар вносят D-циклосерин из расчета 400 мг/л и 50 мл/л желточной эмульсии. Компоненты перемешивают и готовую среду разливают в чашки Петри.
Перфрингенс-агар Шахиди—Фергусона (SFP-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В основной перфрингенс-агар вносят следующие антибиотики: 12 мг/л канамицин-сульфат, 30000 ЕД/л полимиксин В сульфата и 50 мл/л желточной эмульсии. Готовую среду разливают в чашки Петри. На обеих указанных средах вокруг черных колоний С. perfringens образуется опалесцирующая зона, указывающая на лецитиназную активность микроорганизма.
Анаэробный бульон Шадлера (пропись фирмы «Дифко», 1982). По составу среда аналогична анаэробному агару Шадлера, но из нее исключен агар. Используют для выращивания патогенных анаэробов, для определения антибиотикоустойчивости анаэробов методом разведений с выражением результата в виде МИК.
Тиогликолевый бульон (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 0,5 г L-цистина, 2,5 г натрия хлорида, 5,5 г декстрозы, 5 г дрожжевого экстракта, 15 г панкреатического перевара казеина, 0,5 г натрия тиогликолята. Устанавливают рН 7,1, разливают по емкостям и стерилизуют при 121°С 15 минут. Перед использованием среду кипятят и охлаждают.
Рекомендуется для контроля на контаминацию различных материалов анаэробными бактериями.
Анаэробный агар Уилкинс-Чангрена (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 10 г желатинового пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г декстрозы, 5 г натрия хлорида, 1 г L-аргинина, 1 г натрия пирувата, 0,0005 г менадиона, 0,005 г гемина, 10 г агара. Устанавливают рН 7,1, стерилизуют при 121°С 15 минут.
Среда рекомендуется для изоляции анаэробных микроорганизмов из клинических материалов, является стандартной для определения анткбиотикочувствительности анаэробных бактерий. При исключении агара среда может быть использована как питательный бульон.
Обогащенный клостридиальный агар (RCM-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 3 г дрожжевого экстракта, 10 г мясного экстракта, 10 г пептона, 5 г декстрозы, 1 г растворимого крахмала, 5 г натрия хлорида, 3 г натрия ацетата, 0,5 г цистеина гидрохлорида, 15 г агара. Устанавливают рН 6,8, стерилизуют при 121°С 15 минут.
Среда рекомендуется для исследования кишечной микрофлоры. Perry et al. (1955) использовали ее для изучения рубцовых стрептококков, Bornes, Goldberg (1962), внеся в состав хлортетрациклина гидрохлорид или натрия азид, применяли среду для исследования фецес кур. С добавками крови она пригодна для обнаружения в фецес животных и людей лактобацилл, с добавками крови и неомицина — бактероидов.
|
