Учебно-методическое пособие Рекомендовано методической комиссией биологического факультета для студентов ннгу, обучающихся по направлению подготовки 06. 03. 01 «Биология»

Скачать 0.64 Mb.

Название	Учебно-методическое пособие Рекомендовано методической комиссией биологического факультета для студентов ннгу, обучающихся по направлению подготовки 06. 03. 01 «Биология»
страница	3/4
Тип	Учебно-методическое пособие

1 2 3 4

1.4.4. ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)
ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) – метод позволяет регистрировать накопление ДНК ПЦР в реальном времени с использованием флуоресценции и количественно оценить ДНК в образце. Для этой цели применяют флуоресцентные метки (флуорофоры) двух видов:

1) Интеркалирующие флуорофоры – соединения, которые встраиваются в любые двуцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты и повышают интенсивность флуоресценции. Примерами таких красителей может служить SYBR Green или SYBR Gold. Интеркалирующие красители широко используются в научных исследованиях, однако обладают существенным ограничением, поскольку регистрируют все двуцепочечные ДНК, включая неспецифичные продукты реакции.

2) Флуорофоры для меченья олигонуклеотидов – это соединения, интенсивность флуоресценции которых не зависит от связывания с ДНК и регулируется так называемыми гасителями (темновыми или флуоресцирующими).

Олигонуклеотиды меченные парой флуорофор–гаситель, используют в качестве праймеров или зондов (пробы) для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. К настоящему времени разработано множество вариантов структуры меченных парой флуорофор – гаситель олигонуклеотидов. Ниже приведены наиболее часто используемые зонды.

Линейные разрушаемые зонды (TaqMan) – представляют собой олигонуклеотид (25–30 н.о.), в котором 5’-концевой нуклеотид содержит флуорофор, а 3’-концевой нуклеотид – гаситель. В растворе и при отжиге на ДНК такой зонд не флуоресцирует, за сет гасителя. Во время элонгации ДНК полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью, гидролизует зонд на нуклеотиды. В результате этого флуорофор и гаситель попадают в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится. Накопление флуоресценции детектируется прибором при каждом цикле ПЦР. В одной реакции можно использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания.

«Молекулярные маячки» (beacons) – зонд представляет собой небольшую одноцепочечную молекулу ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать пространственную структуру – шпильку. На одном конце олигонуклеотида располагают флуорофор, а на втором – гаситель. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени, которую нужно детектировать. В такой структуре молекулы зонда, находясь в растворе, не флуоресцируют. При отжиге олигонуклеотида на молекуле ДНК мишени, происходит пространственное разнесение флуорофора от гасителя и восстановление флуоресценции.

Примыкающие пробы (Light cyaler) – в этом варианте используют два зонда, которые связывают ДНК-мишень на небольшом расстоянии друг от друга. 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго содержат флуорофор-донор и флуорофор-акцептор, соответственно. При их близком расположении флуорофор-донор поглощает свет определенной длины волны и переносит энергию на флуорофор-акцептор, по флуоресценции которого детектируют продукты амплификации. Применение примыкающих проб также позволяет использовать несколько флуорофоров, с разными спектрами испускания и детектировать в одной пробирке сигнал от разных молекул ДНК.

Анализ данных ПЦР в реальном времени позволяет судить как о присутствии или отсутствии искомой НК, так и оценить ее изначальное количество, за счет регистрации накопления продуктов амплификации в течение всей реакции. Количество исследуемой НК выражают в абсолютных или относительных значениях. Определение абсолютных значений применяют для расчета количества копий НК в пробирке. Для этого необходим внешний контроль с известной концентрацией НК-мишени. Относительные количества определяют для ответа на вопрос: во сколько раз концентрация НК в одном образце больше (или меньше) чем в другом? Для коррекции массы образца, числа клеток, сохранности и количества общей НК проводят нормировку (выравнивание) результатов. Нормировку проводят по числу клеток, по суммарной ДНК, РНК, рибосомальной РНК и др. В исследованиях по определению уровня представленности транскриптов наибольшее распространение получило использование так называемых генов «домашнего хозяйства» (housekeeping genes). Они экспрессируются на постоянном уровне и слабо реагируют на внешние воздействия, поскольку необходимы для поддержания важнейших жизненных функций клетки. При выборе гена домашнего хозяйства, следует учитывать, что уровень их экспрессии может меняться в разных типах клеток.

Расчеты результатов ПЦР в реальном времени достаточно сложны и проводятся в автоматическом режиме с использованием компьютерных программ. Одной из программ для расчета относительного количества ДНК-мишени, находящейся в свободном доступе в сети Интернет, является REST2009. Расчеты основаны на связи интенсивности флуоресцентного сигнала с концентрацией ДНК в пробирке. Сравнивают число циклов амплификации, необходимых для нарастания сигнала флуоресценции в образцах до одной и той же величины. Теоретически концентрация ампликонов при многократном повторении цикла должна возрастать экспоненциально и описывается формулой (4):
С_n = С₀ x 2ⁿ (4)
С₀ – исходное количество ДНК-мишени, С_n – концентрация ампликонов после n циклов
На практике, синтез ампликонов постепенно замедляется по мере истощения компонентов реакционной смеси. Накопление ДНК в ходе ПЦР описывают кривой (рис. 4) и делят на четыре стадии: линейная фоновая фаза, стадия раннего экспоненциального роста количества ампликона, стадия линейного логарифмического роста, стадия выхода на плато.

На стадии раннего экспоненциального роста эффективность амплификации максимальна в сравнении с другими стадиями. Накопление ДНК в ходе ПЦР описывается формулой (5):
С_n = С₀ х (1 + E)ⁿ (5)
С_n – количество продуктов реакции на цикле n; C₀ – изначальное количество исследуемой ДНК на первом цикле; Е – эффективность амплификации. Значение Е находится в пределах от 0 до 1, что соответствует удвоению исходного количества ДНК за цикл, а при Е = 0 образование продукта не происходит
Для сравнения данных между образцами используют один из двух методов. В первом, для расчета величины n используют значение порогового цикла (Ct – от англ. threshold cycle) – точки пересечения кривой накопления флуоресценции и одинаковой для всех образцов пороговой линии. Значение Ct определяется автоматически программным обеспечением к прибору или задается вручную в пределах стадии раннего экспоненциального роста накопления флуоресценции. Во втором, используют метод прямого сравнения графиков. Для определения величины n на кривой находят точку, положение которой отражает форму кривой (Ср – от англ. crossing point). Обычно рассчитывают максимумы первой и второй производных графиков накопления флуоресценции. Значение эффективности амплификации подбирается эмпирически путем последовательных разбавлений образца.

Рис. 4. Зависимость флуоресценции от номера цикла
1 – Линейная фоновая фаза. 2 – Ранний экспоненциальный рост. 3 – Линейный логарифмический рост. 4 – Плато
ПЦР в реальном времени обладает рядом преимуществ, за счет которых с его помощью, например, выявляют и идентифицируют полиморфные локусы HLA, проводят мониторинг посттрансплантационных взаимодействий, генотипируют (выявляют аллели), проводят количественный микросателлитный анализ и пренатальную диагностику генетических заболеваний и т.д.

1.5. Расшифровка первичной структуры (секвенирование)

нуклеиновых кислот
1.5.1. Основные подходы и методы секвенирования
Секвенирование нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) – метод, позволяющий получить описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров (нуклеотидов). Определение нуклеотидной последовательности ДНК стало возможным во второй половине 1970-х годов благодаря стремительному развитию методов молекулярной биологии (использование эндонуклеаз рестрикции, плазмидных векторов, молекулярного клонирования и электрофоретического разделения нуклеиновых кислот и т.д.). Первыми методами секвенирования были метод, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, разработанный А. Максамом и В. Гилбертом, и дидезоксинуклеотидный метод, предложенный Ф. Сэнгером. Метод Сэнгера, в модифицированном и более технологичном виде, получил наибольшее распространение. С развитием самой молекулярной биологии и смежных областей (химия, физика и информатика) были разработаны методы секвенирования нового поколения (next-generation sequencing – NGS), отличающиеся более высокой производительностью. Наиболее производительные методы, обеспечивают чтение миллиардов нуклеотидов в день. Однако, несмотря на наличие технологий с высокой пропускной способностью, дидезоксинуклеотидный метод до сих пор остается «золотым стандартом» определения нуклеотидной последовательности ДНК и широко используется в научно-исследовательских работах.

Секвенирование ДНК дидезоксинуклеотидным методом по Сэнгеру. В основе метода лежит ферментативный синтез комплементарной цепи ДНК с использованием так называемых «терминаторов» или терминирующих дидезоксинуклеотидов – 2'- и 3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ддНТФ: ддATФ, ддTTФ, ддЦTФ и ддГTФ), которые включаясь в растущую цепь ДНК, препятствуют (терминируют) присоединение следующего нуклеотида из-за отсутствия 3'-ОН группы. По теории вероятности, при определенном отношении концентраций дНTФ/ддНTФ и избытке молекул секвенируемой ДНК, синтез строящейся цепи может остановиться на каждом нуклеотиде исследуемого фрагмента ДНК. В итоге синтезируется набор фрагментов ДНК различной длины, 3'-конец которых заканчивается одним из терминаторов. Ф. Сэнгером было предложено проводить четыре реакции для каждого из ддНТФ и анализировать результаты реакции в полиакриламидном геле на соседних дорожках. Нуклеотидная последовательность считывалась по расположению полос на геле.

В настоящее время дидезоксинуклеотидный метод секвенирования ДНК по Сэнгеру, известный так же как метод обрыва растущей цепи, претерпел многочисленные модификации, основанные на современных достижениях (рис. 5). Ферментативный синтез комплементарной цепи ДНК проводится в ходе ПЦР, в которой наряду с дНТФ используют ддНТФ. Каждый из ддНТФ помечен отдельным флуоресцентным красителем (флуорофором), что позволяет проводить реакцию в одной пробирке. Результатом такой ПЦР является синтез пула одноцепочных фрагментов ДНК разного размера и заканчивающихся одним из флуоресцентно-меченных ддНТФ. Полученные фрагменты ДНК очищают от компонентов реакционной смеси, денатурируют и разделяют по длине в линейном полиакриламидном геле методом электрофореза. Используют высоковольтный капиллярный электрофорез, позволяющий разделять фрагменты ДНК, отличающиеся всего на один нуклеотид.

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводят в автоматических капиллярных секвенаторах («GE – MegaBACE», «Beckman Coulter – CEQ», «Applied Biosystems»). При прохождении меченного флуоресцентным красителем фрагмента через зону сканирования лазер, генерирующий непрерывное излучение, возбуждает флуорофор, следующая за этим эмиссия (излучение) флуоресценции улавливается детектирующим устройством. Полученные данные преобразуется с помощью программного обеспечения в текстовую информацию (нуклеотидную последовательность).

Определение нуклеотидной последовательности ДНК по Сэнгеру является самым точным методом секвенирования, но обладает небольшой производительностью. Например, проект «Геном человека», занял приблизительно 13 лет и стоил порядка 3 миллиардов долларов. Однако, разработанные при реализации проекта технические решения, привели к стремительному развитию технологий секвенирования следующего поколения. Например, способ подготовки ДНК, названный методом «дробовика» («shotgun-sequencing»), послужил основой для создания массивного параллельного секвенирования, используемого в следующих поколениях секвенирования (NGS).

Рис. 5. Схема проведения секвенирования ДНК по Сэнгеру

1.5.2. Следующие поколения методов секвенирования
Технологии NGS обладают высокой производительностью, скоростью, остаточно высокой точностью и позволяют решать разнообразные задачи (полногеномное секвенирование, секвенирование геномов и транскриптомов de novо, ресеквенирование с поиском заданной мутации, метагеномные исследования и т.д.). Большое значение для NGS играет биоинформатика, т.к. обработка полученных данных и сборка нуклеотидных последовательностей требует высокопроизводительного программного обеспечения.

Массивное параллельное секвенирование является новым этапом в совершенствовании технологий определения нуклеотидных последовательностей. Часто их относят к методам второго поколения NGS. Принципиальное отличие технологий массивного параллельного секвенирования состоит в возможности одновременного определения первичной структуры пула нуклеиновых кислот, выделенных из различных образцов. Для дифференцировки исследуемых проб используют наборы штрих-кодов или индексов, представляющих собой олигонуклеотиды известной последовательности.

Массивное параллельное секвенирование, представлено четырьмя основными технологиями:

Технология 454 (Roche, Швейцария), известная так же как пиросеквенирование. Принцип технологии основан на детекции хемилюминесцентного сигнала, образующегося в результате высвобождения пирофосфата при встраивании ДНК-полимеразой соответствующего нуклеотида в процессе синтеза комплементарной цепи ДНК (http://www.454.com/).
Секвенирование на молекулярных кластерах (Illumina, США). Технология основана на детекции флуоресцентного сигнала, полученного при встраивании ДНК-полимеразой в растущую цепь ДНК одного из четырех типов дНТФ, отмеченных соответствующим флуорофором (http://www.illumina.com/).
Полупроводниковая технология секвенирования (Ion Torrent/ Life Technologies, США). Принцип технологии основан на детекции изменения рН при выделении одного протона водорода в результате встраивания дНТФ ДНК-полимеразой в реальном времени (http://www.iontorrent.com/).
Циклическое лигазное секвенирование (SOLiD/ Life Technologies, США). Принцип метода основан на сшивании (лигировании) ДНК-лигазой комплементарных одноцепочечной матрице ДНК флуоресцентных зондов (восьмичленных олигонуклеотидов) друг с другом и высвобождении при этом флуоресцентной метки, которая детектируется устройством (http://www.lifetechnologies.com/).

Секвенирование третьего поколения (Next-Next Generation Sequencing – NNGS) основано на определении первичной структуры единичных молекул и характеризуется отсутствием стадии амплификации фрагментов ДНК. Представлено тремя технологиями:

Секвенирование одной молекулы (true Single Molecule Sequencing, tSMS; Helicos BioSciences, США). Принцип метода основан на построении комплементарной фрагменту ДНК цепи при добавлении меченых нуклеотидов, при этом в местах связывания детектируется свечение, после чего метки от присоединенных нуклеотидов удаляют и вводят следующий тип меченых нуклеотидов. В настоящее время компания Helicos BioSciences прекратила свое существование, и данная технология не поддерживается.
Секвенирование единичных молекул в реальном времени (Single Molecule RealTime, SMRT; Pacific BioSciences, США). Принцип метода основан на достройке в режиме реального времени комплементарной однонитевой матрице цепи ДНК-полимеразой, закрепленной на дне специальных ячеек, при этом сигнал от каждого присоединившегося нуклеотида, помеченного определенной светящейся меткой, фиксируется прибором (http://www.pacificbiosciences.com/).
Секвенирование через нанопоры (Oxford Nanopore Technologies, Англия). Принцип метода основан на протягивании через нанопору отрицательно заряженного одноцепочечного фрагмента ДНК, при этом регистрируется изменение электропроводности нанопоры с помощью электродов по мере прохождения через нее нуклеотидов, каждому из которых (в силу физического различия нуклеотидных оснований) соответствует определенное изменение электропроводности (https://nanoporetech.com/). Существуют также другие варианты реализации секвенирования ДНК через нанопоры, но в настоящее время научно-исследовательские разработки нанопорных секвенаторов находятся на опытно-конструкторской стадии.

Таким образом, современные методы секвенирования продолжают активно развиваться и совершенствоваться для выполнения разноплановых задач, связанных с определением нуклеотидной последовательности ДНК, а так же с целью увеличения производительности, скорости и точности секвенирования.
1.6. Методы иммунного анализа
При проведении лабораторных исследований часто возникает необходимость определить наличие или количественное содержание ряда биологических компонентов (гормонов, ферментов, нейропептидов, продуктов иммунной системы, антигенов и т.д.). Данная задача может быть решена с использованием методов иммунного анализа, основанного на специфическом связывании антитела с антигеном, при котором к одному из компонентов химически присоединена метка. Данные методы дают возможность идентифицировать исследуемые соединения в низких и очень низких концентрациях (до 5 пкг/мл). В зависимости от типа используемой метки и способа детекции сигнала иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и др.

Наиболее распространенным в настоящее время является ИФА, использующий в качестве метки фермент. При детекции в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратом образуется окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически. Использование ИФА в лабораторной практике значительно расширилось с появлением возможности иммобилизации антигена и антитела на твердых носителях с сохранением их связывающей активности. По типу химического взаимодействия на первой фазе анализа при связывании определяемого компонента методы иммунного анализа можно разделить на конкурентные и неконкурентные. В случае использования неконкурентного метода в системе присутствуют только анализируемый компонент и специфические антитела с соответствующими центрами связывания. При конкурентном варианте ИФА меченый ферментом анализируемый компонент иммобилизуется на твердой фазе, а в системе присутствует еще и его аналог, конкурирующий за центры специфического связывания.

По стадиям проведения различают прямой и непрямой варианты анализа. В случае прямого ИФА используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой, являющейся субстратом ферментативной реакции. В непрямом анализе два этапа. При проведении первого этапа используют немеченые антитела к выявляемым антигенам, а на втором этапе добавляют антивидовые меченые антитела. Чаще всего для первого этапа используются мышиные, а для второго – козьи антитела.

Наиболее удобным в постановке является «сэндвич»-метод. На первом этапе анализа на полистироловом планшете адсорбируются антигены или антитела в заранее подобранной концентрации. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты удаляются отмыванием. В сенсибилизированные лунки вносятся исследуемые образцы. В лунки с положительным и отрицательным контролем вносятся стандартные реагенты, содержащие или не содержащие исследуемый компонент. При необходимости анализа количественного содержания белка вносятся калибровочные растворы. После этого планшет инкубируют с использованием термошейкера или термостата. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием. На следующей стадии в лунки планшета вносится конъюгат антитело-фермент или антиген-фермент, который и связывается с иммобилизованным иммунным комплексом, при этом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Последующая инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии и по оптической плотности оценить выраженность окрашивания.

Развитию ИФА способствовало создание моноклональных антител, продуцируемых гибридомой, полученной в результате слияния иммунокомпетентной клетки В-лимфоцита и клетки миеломы мышей. Моноклональные антитела несут только одну химически однородную популяцию антител, комплементарную специфической детерминанте антигена, что позволяет осуществлять тонкую дифференциацию белков. В настоящее время развитие иммуноферментного анализа идет как по линии повышения чистоты антигенов и антител, так и по линии создания автоматизированных систем постановки реакций и их инструментального учета.

В настоящее время приобретает популярность ИФА с использованием магнитных частиц (MPEIA). В данном случае образование иммунных комплексов осуществляется на полистироловых магнитных шариках диаметром около 0,8 мкм, которые помещают в лунки планшета. Особенностью данного метода является то, что стадии промывки и детекции результатов проводят с дополнительным использованием магнитного сепаратора, с помощью которого шарики фиксируюся на дне лунки. Для данного метода также существует модификация с использованием флуоресцентных меток, позволяющая увеличить число определяемых в одном измерении компонентов за счет использования шариков разного цвета, детектируемых с помощью специального анализатора (технология Bio-Plex).

2. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
ЗАНЯТИЕ №1. Выделение нуклеиновых кислот из клеток E. Сoli
Целью работы является освоение метода очистки нуклеиновых кислот от белков и липидов с использованием смеси фенола и хлороформа.

Метод позволяет получать препараты нуклеиновых кислот клеток E. coli, штамм Top 10., пригодные для электрофоретического анализа в агарозном геле.
Необходимые реактивы

Среда Лурия-Бертани (LB) следующего состава (г/л): бактотриптон – 10 г/л, дрожжевой экстракт – 5 г/л, хлорид натрия – 5 г/л, гидроокись натрия – 0,008 М, рН 7,5, ампициллин – 100 мг/л. Среду стерилизуют автоклавированием при 105С в течение 1 ч.
Физиологический раствор – 0.9 % раствор NaCl .
Смесь фенола, насыщенного водой, рН 8,0, с хлороформом в соотношении 1:1.
Дистиллированная вода.

Ход работы

Клетки E. coli растят в жидкой среде LB в течение 6 – 8 часов при 37С на качалке до стационарной фазы роста.
В пробирку объемом 1,5 мл помещают 1 мл суспензии клеток. Клетки осаждают центрифугированием в течение 30 секунд при 10–14 тыс. об/мин. Удаляют надосадочную жидкость.
Осадок ресуспендируют в 1 мл физиологического раствора. Клетки повторно осаждают центрифугированием в течение 30 секунд при 10–14 тыс. об/мин и удаляют надосадочную жидкость.
Осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и добавляют 100 мкл смеси фенола с хлороформом. Тщательно перемешивают и центрифугируют при 10–14 тыс. об/мин в течение 15 минут.

Результатом проделанной работы должно явиться разделение фаз в пробирке (рис. 6): Нижняя фаза содержит смесь фенола с хлороформом; интерфаза – разрушенные клетки (клеточный дебрис) и денатурированные белки; верхняя (водная) фаза – раствор нуклеиновых кислот.

Водную фазу в объеме 50 мкл переносят в чистую пробирку и используют для электрофоретического анализа нуклеиновых кислот.

Водная фракция с

нуклеиновой кислотой

Белковая фракция

Фенол/хлороморменная фракция
Рис. 6. Разделение фаз в пробирке после центрифугирования

ЗАНЯТИЕ №2. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
Одним из наиболее часто используемых способов разделения и визуализации нуклеиновых кислот является электрофорез в агарозном геле, содержащем флуоресцентный краситель - бромид этидия. В этом случае фрагменты нуклеиновых кислот разделяются под действием электрического поля и обнаруживаются затем в ультрафиолетовом свете в виде ярких светящихся оранжевых полос.

Целью работы является выявление штаммов E. coli содержащих плазмидную ДНК с использованием метода электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле.
Необходимые реактивы

Трис-ацетатный электродный буферный раствор (ТАЕ). 100 мл пятидесятикратного концентрата (50Х) ТАЕ содержит 24,2 г трис-(гидроксиметил)аминометана, 5,7 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0.5 М раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), рН 8,0.
Рабочий раствор ТАЕ готовится путем разбавления 1 объема 50Х концентрата ТАЕ 49 объемами дистилированной воды.
Буферный раствор для нанесения проб.
Десятикратный концентрат (10Х) буферного раствора для нанесения проб содержит 10Х концентрат ТАЕ, 50% глицерина (вес/объем), 0,25% бромфенолового синего в дистилированной воде.
Агарозный гель 1%-ный.
В 100 мл рабочего раствора ТАЕ разводят 1 г агарозы и добавляют 10 мкл 10%-ного водного раствора бромида этидия^!. Суспензию нагревают на водяной бане до полного растворения агарозы, периодически помешивая. Раствору дают остыть примерно до 50 С и заливают в форму для агарозного блока, вставляют гребенку для образования лунок и дают агарозе застыть до состояния геля.

Работу с бромидом этидия проводите в резиновых перчатках.
Ход работы

Удаляют гребенку из застывшей агарозы, помещают гель в камеру для электрофореза лунками к отрицательному электроду и заливают рабочим буферным раствором ТАЕ, покрыв гель раствором на 5 мм.
Смешивают 10 мкл раствора нуклеиновых кислот, выделенных из E. сoli на предыдущем этапе работы, и 1 мкл буфера для нанесения проб. Полученную смесь вносят в лунки геля.
Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Электрофорез проводят в течение 45 минут при напряжении 200 вольт (краситель должен пройти не менее 3 см геля). Затем отключают ток.
Помещают гель в окно трансиллюминатора и закрывают крышку прибора (для защиты глаз). Включают трансиллюминатор и проводят визуализацию результатов.
Фрагменты нуклеиновых кислот наблюдаются в виде набора ярких светящихся оранжевых полос (рис. 7).
Используя электрофореграмму определяют штаммы E. Coli содержащие плазмидную ДНК.

1 2 3 4

Рис. 7. Электрофореграмма нуклеиновых кислот, выделенных из E. сoli
1, 3 – образцы с плазмидной ДНК; 2, 4 – образцы без плазмидной ДНК

ЗАНЯТИЕ №3. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
В работе используют два штамма E. coli Тор 10 трансформированные плазмидами pET16b или pET22b, которые придают клеткам устойчивость к анмпицилину. Плазмиды pET серии предназначены для экспрессии рекомбинантных белков в клетках E. coli. В структуре плазмид содержится регион MCS (от англ. Multiple cloning sites), содержащий множественные сайты рестрикции, предназначенные для лигирования плазмидной ДНК с ДНК гена интереса. Плазмида pET22b отличается от pET16b присутствием в MCS дополнительной нуклеотидной последовательности кодирующей лидерный пептид белка pelB, предназначенный для локализации рекомбинантного белка в периплазмотическом пространстве клеток E. сoli. Метод ПЦР в реальном времени позволяет обнаружить данные различия, а также сравнить количество плазмидной ДНК между образцами культур клеток E. coli. MCS расположен между промотором и терминатором ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7, которые регулируют экспрессию рекомбинантного белка. Праймеры специфичные к нуклеотидной последовательности промотора и терминатора бактериофага Т7, позволяют амплифицировать фрагмент ДНК MCS обеих плазмид. Сравнение кривых плавления продуктов ПЦР, позволяет отличить фрагмент содержащий вставку в исследуемой последовательности (MCS pET22b) по более высокой температуре плавления. Сравнение кривых флуоресценции позволяет оценить количество плазмидной ДНК в штаммах трансформированных pET16b и pET22b.

Целью занятия является дифференциальная диагностика культур E. coli содержащих плазмиды pET16b и pET22b и их количественное сравнение с использованием метода полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Задача работы

Нормировать образцы культур E. Coli по оптической плотности суспензии клеток.

Провести ПЦР в реальном времени.

Определить температуры плавления полученных фрагментов ДНК.

Оценить количество плазмидной ДНК.
Необходимые реактивы

Среда Лурия-Бертрани (LB) следующего состава (г/л): бактотриптон – 10 г/л, дрожжевой экстракт – 5 г/л, хлорид натрия – 5 г/л, гидроокись натрия – 0,008 М, рН 7,5, ампициллин – 100 мг/л. Среду стерилизуют автоклавированием при 105С в течение 1 ч.
Физиологический раствор – 0,9% раствор NaCl .
Десятикратный концентрат (10Х) буферного раствора для Taq-полимеразы – 100 мМ трис-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂.
Водный раствор 8 mM дНТФ, содержащий 2 mM АТФ, 2 mM ТТФ, 2 mM ГТФ, 2 mM ЦТФ.
Раствор Taq-полимеразы в буфере для хранения (5 единиц активности в мкл).
Растворы 1 nM олигонуклеотидов, служащих прямым (F) и обратным (R) праймерами. Олигонуклеотиды имеют следующие последовательности:

T7 5’-ATgggTATTCAACATTTC-3’ – прямой (F) праймер

T7 5’-gTTACCAATgCTTAATCA-3’ – обратный (R) праймер

Интеркалирующего красителя SYBR Green (1000Х) 0,5 мкл
Дважды дистиллированная вода (2д. H₂O).

Ход работы

Подготовка проб

Клетки E. coli растят в жидкой среде LB при 37С на качалке до экспоненциальной фазы роста.
С использованием 1 мл суспезии клеток, определяют оптическую плотность. Культуры разводят до оптической плотности 0.2, 0.4 и 0.6, с использованием среды LB.
В пробирку объемом 1,5 мл помещают 50 мкл нормированной суспензии клеток. Клетки осаждают центрифугированием в течение 30 секунд при 10–14 тыс. об/мин. Удаляют надосадочную жидкость.
Осадок ресуспендируют в 1 мл физиологического раствора. Клетки повторно осаждают центрифугированием в течение 30 секунд при 10–14 тыс. об/мин и удаляют надосадочную жидкость.
Осадок ресуспендируют в 100 мкл дважды дистиллированной воды и используют для проведения ПЦР.

Полимеразная цепная реакция

При проведении ПЦР используется только одноразовые пробирки и одноразовые наконечники для микродозаторов. Для каждой операции необходимо использовать отдельные наконечники. Полимеразную цепную реакцию проводят в одноразовых пробирках объемом 0,2 мл, с оптически прозрачными крышками.

Используя только индивидуальные для каждого компонента наконечники, смешивают в отдельной пробирке компоненты реакции, за исключением исследуемого образца ДНК*. Наименование и объем компонентов ПЦР, необходимых для проведения одной реакции приведен в таблице 1.
В пробирку объемом 0,2 мл вносят 23 мкл приготовленной реакционной смеси.
Индивидуальным для каждого исследуемого образца наконечником вносят 2 мкл суспензии клеток, полученной на предыдущем этапе, непосредственно в реакционную смесь.
Компоненты перемешивают, используя прибор для встряхивания (вортекс), и проводят краткое центрифугирование реакционной смеси.

Таблица 1

Объемы смешиваемых компонентов ПЦР

Реагенты	Объем (мкл)
10Х ПЦР буфер	2,5
dNTP	2,0
F праймер	0,5
R праймер	0,5
Taq-полимераза	0,5
Зонд	0,5
ДНК *(суспензия клеток)	2*
2д. H₂O	16,5

1 2 3 4

	Учебно-методическое пособие Рекомендовано методической комиссией... Учебно-методическое пособие предназначено для студентов бакалавриата, обучающихся по направлению 38. 03. 01 «Экономика» в Институте...		Учебно-методическое пособие Рекомендовано методической комиссией... А-64 Ангелова О. Ю., Дмитриева Е. М. Маркетинг. Рабочая тетрадь.– Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2014. – 97 с
	Учебно-методическое пособие Рекомендовано методической комиссией... А-64 Ангелова О. Ю., Дмитриева Е. М. Маркетинг. Рабочая тетрадь.– Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2014. – 97 с		Учебно-методическое пособие Рекомендовано методической комиссией... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородский государственный...
	Коммерция Практикум Рекомендовано методической комиссией филологического факультета для студентов спо ннгу им. Н. И. Лобачевского, обучающихся по направлению...		Руководство к решению задач часть II случайные величины учебно-методическое... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
	Ннгу, обучающихся по направлению подготовки 080800 «Прикладная информатика... Рекомендовано методической комиссией факультета вычислительной математики и кибернетики для студентов ннгу, обучающихся по направлению...		Пособие для преподавателей русского языка, ведущих занятия с иностранными... Рекомендовано методической комиссией филологического факультета для слушателей подготовительного отделения факультета иностранных...
	Проектирование деталей Рекомендовано методической комиссией физического факультета для студентов ннгу, обучающихся по направлениям подготовки 210100 «Электроника...		Учебно-методическое пособие Рекомендовано методической комиссией... Учебно-методическое пособие предназначено для организации активной самостоятельной работы студентов над учебным материалом при изучении...
	Учебно-методическое пособие Рекомендовано методической комиссией... Учебно-методическое пособие предназначено для организации активной самостоятельной работы студентов над учебным материалом при изучении...		Н. Г. Титова Т. П. Логинова экономик а учебное пособие Рекомендовано ученым советом факультета Физической культуры и спорта для студентов ннгу, обучающихся по направлению подготовки
	Методические указания к выполнению лабораторных работ по спецкурсу... Рекомендовано методической комиссией факультета вмк для студентов ннгу, обучающихся по направлениям подготовки 010500 «Прикладная...		Учебное пособие Рекомендовано методической комиссией института экономики... Национальный исследовательский нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского
	Методические рекомендации по дисциплине «Организационное поведение» Учебно-методическое пособие предназначено для студентов и слушателей ннгу, обучающихся по направлению подготовки 38. 03. 02 «Менеджмент»...		Методические указания по выполнению самостоятельной работы по дисциплине «Русский язык» Рекомендовано методической комиссией института экономики и предпринимательства для студентов ннгу, обучающихся по

Реагенты

Объем (мкл)

ДНК *(суспензия клеток)

Похожие: