1.5. Методические процедуры
Гематологические исследования
Гемоглобин
В видалевскую пробирку набирают 0.4 мл физиологического раствора хлорида натрия, затем 20 мкл крови, и добавляют 2% раствор сапонина для разрушения эритроцитов. С помощью фотоэлектрокалориметра определяют экстинкцию полученного раствора при 578 (570–580) нм и по таблице определяют содержание гемоглобина.
Гематокрит
Определение проводят в микрогематокрите, представляющем собой стеклянную капиллярную трубку, разделенную на 100 равных частей. Кончик микрогематокрита помещают в пробу крови ниже уровня поверхности. После заполнения трубки кровью ее кончик запаивают в пламени горелки. Трубку центрифугируют 30 мин при 3 000 об/мин. Определяют процентное содержание красных клеток крови.
Количество эритроцитов
В видалевскую пипетку набирают 0.4 мл физиологического раствора хлорида натрия, затем 20 мкл крови, и тщательно перемешивают. Полученным раствором заполняют камеру Горяева, которую помещают под микроскоп (объектив 8X, окуляр 10X или 15X). Проводят подсчет количества эритроцитов в пяти больших квадратах камеры Горяева и вычисляют содержание эритроцитов в крови по формуле.
СОЭ
Кровь смешивают в соотношении 4:1 с физиологическим раствором хлорида натрия, содержащим цитрат натрия. Полученный раствор набирают в капиллярную пипетку. Через 1 час по делениям на капиллярной пипетке определяют высоту освободившегося от эритроцитов столбика плазмы.
Количество лейкоцитов
В серологическую пробирку помещают 0.4 мл 3–5% уксусной кислоты, подкрашенной метиленовым синим, добавляют 20 мкл крови, закрывают резиновой пробкой и перемешивают. Подсчет лейкоцитов проводят под микроскопом в камере Горяева.
Лейкограмма
Мазки крови делают на предметных стеклах. Стекла кипятят в течение 15–20 мин и промывают в воде, затем замачивают в смеси Никифорова (этиловый спирт и серный эфир 1:1). Делают мазок из капли крови, высушивают его на воздухе до исчезновения влажного блеска, затем фиксируют метиловым спиртом и окрашивают приготовленной ex tempore краской Романовского. После окраски краситель смывают водой, мазки ставят в сушильный шкаф для просушивания. Приготовленные мазки помещают под микроскоп и определяют процентное соотношение различных типов лейкоцитов (счет 200 клеток).
Тромбоциты
Используют метод Фонио. Капилляром Панченкова набирают 14% раствор сульфата магния и вносят в видалевскую пробирку, добавляют кровь. Содержимое хорошо перемешивают, готовят мазки, фиксируют и окрашивают так же, как для подсчета лейкограммы. Время окраски увеличивают до 2–3 часов. Под микроскопом подсчитывают количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов.
Ретикулоциты
В видалевскую пробирку помещают каплю краски (хлорид натрия, метиленовый синий, азур-1) и каплю крови, хорошо перемешивают и оставляют на 2–3 часа для прокрашивания. Делают мазок, высушивают его и подсчитывают количество ретикулоцитов на 1000 эритроцитов.
Миелограмма
Готовят мазки пунктатов костного мозга и окрашивают их так же, как для подсчета лейкограммы. Подсчитывают соотношение различных клеток костного мозга (счет 1000 клеток).
Биохимические исследования сыворотки крови
Общий белок
Принцип метода: белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью и образуют соединения, окрашенные в фиолетовый цвет. Биуретовый реактив — 4.5г KNaC4H4O6 (4-водный виннокислый калий/натрий) — растворяют в 40 мл 0.2N NaOH. Добавляют 1.5 г CuSO4 · 5H2O и 0.5 г йодистого калия; доводят раствор до 100 мл 0.2N NaOH. 20 мл полученного раствора смешивают с 80 мл 0.5% раствора йодистого калия в 0.2N NaOH. К 5 мл биуретового реактива добавляют 0.1 мл полученной путем центрифугирования сыворотки крови. Через 30 мин измеряют экстинкцию раствора на фотоэлектрокалориметре при 546 нм (540–560 нм). Для построения калибровочной кривой серию эталонных растворов альбумина (40–100 мг в пробе) обрабатывают так же, как и опытные пробы. Концентрацию белка в пробах определяют по калибровочной кривой. Результаты выражают в г/л.
Аспартатаминотрансфераза (АСТ)
Принцип метода: образующаяся в результате ферментативного переаминирования пировиноградная кислота взаимодействует с 2,4-динитрофенилгидразином; гидразон пировиноградной кислоты в щелочной среде дает зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты. В пробирку вносят 0.5 мл субстратного раствора (0.1 мМ фосфатный буфер, pH 7.4, содержащий -кетоглутаровую кислоту и аспарагиновую кислоту), инкубируют при 37°C в течение 3 мин, затем добавляют 0.1 мл сыворотки, полученной путем центрифугирования образца периферической крови животных. Проводят инкубацию в течение 60 мин при 37°C в термостате. Добавляют 0.5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и инкубируют раствор в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем вносят 5 мл 0.4 N раствора NaOH и через 10 мин измеряют оптическую плотность проб на фотоэлектрокалориметре при 530 нм (500–560 нм). Активность фермента определяют по калибровочной кривой, построенной путем проведения описанных выше процедур с калибровочными растворами пировиноградной кислоты (0.05–0.30 мкМ). Результаты выражают в единицах ферментативной активности U/л (U соответствует количеству фермента, катализирующего превращение 1 мкМ субстрата в течение 1 мин).
Аланинаминотрансфераза (АЛТ)
Метод аналогичен методу определения АСТ, но субстратный раствор вместо аспарагиновой кислоты содержит аланин.
Лактатдегидрогеназа
Принцип метода: лактат в щелочной среде в присутствии ЛДГ и NAD окисляется в пируват, по степени образования которого судят об активности фермента. Количество 0.1 мл полученной путем центрифугирования сыворотки крови разводят 1:2, смешивают с 0.3 мл раствора NAD и инкубируют при 37°C в течение 5 мин. Реакцию инициируют путем внесения нагретых до 37°C растворов 0.03 М пирофосфата натрия (0.3 мл) и 0.45 М лактата натрия (0.2 мл). Полученную смесь инкубируют в течение 15 мин при 37°C. По окончании инкубации к реакционной смеси добавляют 0.5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и инкубируют пробы в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавляют раствор гидроокиси натрия, через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре (510 нм). Активность ЛДГ определяют по калибровочному графику, полученному путем измерения оптической плотности растворов пировиноградной кислоты (0.01–0.2 мкМ), инкубированных в присутствии динитрофенилгидразина. Результаты выражают в единицах ферментативной активности (U/л).
Щелочная фосфатаза
Принцип метода: щелочная фосфатаза катализирует гидролиз нитрофенилфосфата с образованием нитрофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание. В пробирки вносят по 1 мл субстратно-буферного раствора (0.05 М глюкаминовый буфер, pH 10.1, нитрофенилфосфат натрия) и инкубируют при 37°C в течение 5 мин. Реакцию инициируют путем добавления 0.1 мл полученной путем центрифугирования сыворотки крови. Инкубируют 30 мин при 37°C. В пробирки добавляют по 10 мл 0.02 N раствора NaOH и через 5 мин измеряют оптическую плотность раствора с помощью фотоэлектрокалориметра (400–420 нм). Активность фермента определяют по калибровочной кривой, полученной путем изменения оптических плотностей щелочных растворов нитрофенола (0.05–735 мкМ). Результаты выражаются в единицах ферментативной активности (U/л).
Мочевина
Принцип метода: мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии с тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенные вещества. В пробирку вносят 0.8 мл воды, 0.2 мл сыворотки крови, полученной путем центрифугирования, и 1.0 мл трихлоруксусной кислоты (1 г/мл). После перемешивания выжидают 15–20 мин и центрифугируют смесь. 0.5 супернатанта переносят в пробирку и добавляют 5 мл цветного реактива (5.0 мМ диацетилмонооксим, 0.9 мМ серная кислота, 25.0 мМ соль трехвалентного железа). Пробирку закрывают алюминиевой фольгой и инкубируют в течение 20 мин в кипящей бане. Содержимое пробирки охлаждают в токе холодной воды и измеряют оптическую плотность раствора на фотоэлектрокалориметре при 500–560 нм. Аналогично обрабатывают эталонную пробу, в которой вместо сыворотки крови используют 0.2 мл стандартного раствора мочевины (1 г/л). Содержание мочевины определяют путем умножения отношения экстинкции опытной пробы к экстинкции эталонной пробы на коэффициент 15.65 (мМ мочевины в стандартном растворе). Результат выражают в мМ.
Креатинин
Принцип метода: в его основе лежит способность креатинина реагировать в щелочной среде с пикриновой кислотой с образованием окрашенного соединения. Количество 2.0 мл полученной путем центрифугирования сыворотки крови смешивают в пробирке с 6.0 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Через 5 мин пробирку помещают на 15–20 сек в кипящую баню для осаждения белка. Содержимое пробирки центрифугируют, к 4.0 мл супернатанта добавляют 0.2 мл раствора NaOH (0.1 г/л). Через 10 мин определяют оптическую плотность раствора в фотоэлектрокалориметре при 530 нм (500–560 нм). Аналогично обрабатывают эталонную пробу. Вместо сыворотки используют стандартный 8.80 мМ раствор креатинина (1 мг/мл). Содержание креатинина определяют путем умножения отношения экстинкции опытной пробы к экстинкции эталонной пробы на коэффициент 8.80 (мМ креатинина в стандартном растворе). Результат выражают в мМ.
Глюкоза
Принцип метода: глюкоза в присутствии гидрооксидаз окисляется с образованием перекиси водорода, которая окисляет ортолидин, превращая его в окрашенное соединение. В пробирку помещают 1.1 мл физиологического раствора хлорида натрия, добавляют 0.1 мл полученной путем центрифугирования сыворотки крови, 0.4 мл раствора ZnSO4 · 7H2O (50 мг/мл) и 0.4 мл 0.3 N раствора NaOH. Содержимое пробирки перемешивают, через 10 мин центрифугируют при 2500 об/мин в течение 10 мин. Отбирают 1 мл супернатанта и добавляют 3 мл энзимохромогенной смеси (0.25 М ацетатный буфер pH 4.8, глюкооксидаза 2 U/мл, пероксидаза 0.01 мг/мл, ортолидин (3,3-диметилбензидин) 0.1 мг/мл). Через 20–23 мин измеряют экстинкцию раствора на фотоэлектрокалориметре при 625 нм. Аналогично обрабатывают эталонную пробу. Вместо сыворотки используют стандартный 2.0 мг/мл (11.0 ммоль/л) раствор глюкозы. Содержание глюкозы в крови определяют путем умножения отношения экстинкции опытной пробы к экстинкции эталонной пробы на коэффициент 11.0 (концентрация стандартного раствора). Результат выражают в ммоль/л.
Общие липиды
Принцип метода: продукты распада насыщенных липидов образуют с фосфованилиновым реактивом окрашенное соединение. К 0.05 мл полученной путем центрифугирования сыворотки крови добавляют 2.5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и помещают на 10 мин в кипящую водяную баню. Пробирку охлаждают проточной водой. 0.2 мл пробы добавляют к 3 мл фосфованилинового реактива (раствор ванилина 6 мг/мл и концентрированная ортофосфорная кислота, смешанные в соотношении 1:4). После перемешивания пробы оставляют на 45 мин при комнатной температуре. Измеряют экстинкцию раствора на фотоэлектрокалориметре при 500–560 нм. Аналогично обрабатывают эталонную пробу. Вместо сыворотки используют стандартный 12.0 г/л раствор триолеина в хлороформе. Концентрацию общих липидов определяют путем умножения отношения экстинкции опытной пробы к экстинкции эталонной пробы на коэффициент 12.0 (концентрация стандартного раствора). Результат выражают в г/л.
Холестерин
Принцип метода: холестерин в присутствии уксусного ангидрида и смеси серной и уксусной кислот дает окрашивание раствора. К 2.1 мл кислотной смеси (ледяная уксусная кислота, уксусный ангидрид, концентрированная серная кислота, абсолютный этиловый спирт, хлороформ) медленно добавляют 0.1 мл полученной путем центрифугирования сыворотки крови. Пробу перемешивают и инкубируют в течение 20 мин при 37°C. Измеряют оптическую плотность раствора при 630–690 нм. Для построения калибровочной кривой серию эталонных растворов холестерина (0.1–0.45 мг в пробе) обрабатывают так же, как опытные пробы. Содержание холестерина определяют по калибровочной кривой. Результаты выражают в ммоль/л.
Билирубин и его фракции
Принцип метода: при взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая, реагируя со связанным билирубином сыворотки, дает розово-фиолетовое окрашивание. По интенсивности окраски судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. При добавлении к сыворотке кофеинового реактива несвязанный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он так же, как и связанный билирубин, вызывает окрашивание раствора диазореактивов. В три пробирки (для определения общего билирубина, связанного билирубина и постановки контрольной реакции) вносят полученную путем центрифугирования сыворотку крови, кофеиновый реактив (водный раствор кофеина 50 г/л, бензойнокислого натрия 75 г/л и уксуснокислого натрия 125 г/л) и диазосмесь (подкисленный соляной кислотой раствор сульфаниловой кислоты 5 г/л и раствор азотистокислого натрия 5 г/л, смешанных ex tempore в соотношении 3:1) согласно схеме:
Реактив
|
Общий
билирубин
|
Связанный
билирубин
|
Контрольная
группа
|
Сыворотка
|
0.50 мл
|
0.50 мл
|
0.50 мл
|
Кофеиновый реактив
|
1.75 мл
|
–
|
1.75 мл
|
Физраствор
|
–
|
1.75 мл
|
0.25 мл
|
Диазосмесь
|
0.25 мл
|
0.25 мл
|
–
|
Для определения общего билирубина пробу выдерживают в течение 20 мин, связанного — 5–10 мин. Определяют оптическую плотность растворов на фотоэлектрокалориметре при 500–560 нм. Для построения калибровочной кривой серию эталонных растворов билирубина (17–85 мкмоль/л) обрабатывают так же, как опытные пробы. Концентрацию общего и связанного билирубина определяют по калибровочной кривой. Для определения уровня связанного (свободного) билирубина вычисляют разность между величинами концентрации общего и связанного билирубина. Результаты выражают в мкмоль/л.
Натрий, калий, кальций
Принцип метода: натрий, калий и кальций сыворотки крови определяют с помощью метода плазменной фотометрии, который основан на способности химических элементов возбуждаться и испускать лучи света определенной длины волны при сжигании солей минеральных веществ в пламени. Для определения концентрации натрия плазму крови разводят водой 1:100, калия и кальция — 1:10. Плазменный фотометр калибруют по стандартным растворам и определяют содержание электролитов в образцах плазмы крови. Результаты выражают в ммоль/л.
Исследование мочи
Удельный вес
Удельный вес определяют путем взвешивания 1 мл мочи.
Реакция
Реакцию мочи определяют путем измерения ее pH.
Микроскопия осадка
Мочу центрифугируют, из осадка готовят мазки для счета под микроскопом эритроцитов, лейкоцитов, эпителиальных клеток и цилиндров.
Белок
К 5 мл мочи добавляют 1 мл 10% трихлоруксусной кислоты для осаждения белка. Полученную взвесь центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, к осадку приливают 5 мл биуретового реактива. Дальнейший ход процедуры соответствует методу определения концентрации общего белка в сыворотке крови.
Глюкоза
Метод качественного определения глюкозы в моче основан на способности глюкозы восстанавливать в щелочной среде при нагревании гидрат окиси меди (синего цвета) в гидрат закиси меди (желтого цвета). К 6–8 мл мочи прибавляют 20 капель реактива гидрата окиси меди до появления голубоватой окраски, перемешивают и нагревают верхнюю часть пробирки до начала кипения. При наличии глюкозы в моче появляется желтая окраска в верхней части пробирки.
Кетоновые тела
Метод основан на способности нитропруссида натрия в щелочной среде реагировать с кетоновыми телами (ацетоуксусной кислотой, -оксимасляной кислотой и ацетоном) с образованием комплекса красно-фиолетового цвета. 200 мг сухого сульфата аммония, 5 капель мочи и 2 капли раствора нитропруссида натрия тщательно перемешивают в пробирке, на полученную смесь осторожно наслаивают 10–15 капель водного раствора аммиака. При наличии в моче кетоновых тел на границе раздела фаз в течение 3–5 мин образуется красно-фиолетовое кольцо, интенсивность окраски которого позволяет судить о концентрации кетоновых тел.
Желчные пигменты (билирубин)
Метод основан на способности связанного билирубина при соединении с диазотированной сульфаниловой кислотой окрашивать раствор в розовый цвет. К 10 мл мочи, подкисленной несколькими каплями уксусной кислоты, добавляю 5 мл 10% раствора хлорида бария, перемешивают, фильтруют через бумажный фильтр. Фильтр раскладывают на две чашки Петри, на осадок наносят 1–2 капли свежеприготовленной диазосмеси, 4 капли спирта и 1 каплю двузамещенного фосфата натрия. При положительной пробе появляется красно-фиолетовая окраска. Оставляют на 2–3 часа для прокрашивания. Делают мазок, высушивают его и подсчитывают количество ретикулоцитов на 1000 эритроцитов.
Нагрузочные пробы
Проба с феноловым красным
Принцип метода. Для оценки секреторной функции извитых канальцев почек используют нагрузку красителем и по количеству выведенной краски судят о скорости секреции. После энтеральной водной нагрузки (5 мл/100 г веса) крысе вводят внутривено 0.2 мл раствора красителя фенолрот и помещают ее на 2 часа в обменную клетку. Измеряют диурез, 1 мл мочи переносят в мерную пробирку, добавляют 0.2 мл 10% р-ра КОН и доводят до объема 10 мл водой. Измеряют оптическую плотность полученного раствора при 540 нм. Концентрацию фенолового красного в моче определяют по калибровочной кривой.
Гексеналовая проба
Принцип метода. Детоксицирующую функцию печени оценивают по продолжительности наркотического (гексеналового) сна. Крысе вводят внутрибрюшинною 2% р-р гексенала в дозе 90 мкл/кг. Регистрируют в минутах время наступления наркоза (переход в боковое положение тела) и выхода из наркоза (переворачивание).
Физиологические исследования
Открытое поле
Аппаратура. Прямоугольная камера с деревянными боковыми и задней стенками и передней стеклянной стенкой (60х60х60 см). Поля камеры приподнят и разделен на 9 квадратов с отверстиями для регистрации исследовательской активности. Над камерой размещен источник света. Характер и количество движений отмечает регистратор.
Процедура. Регистрируют 6 компонентов поведения в течение 4-х минут наблюдения: латентный период выхода, вертикальную и горизонтальную активность, количество заглядываний в норки, груминг и болюсы. Тестирование проводят в фоне и после окончания введения. Для определения выраженности эффекта используют отношение количества движений в опыте/ контроле.
Спонтанная двигательная активность (СДА)
АППАРАТУРА. Автоматическая система регистрации движений.
Процедура. Крысу помещают на 5 минут в камеру для получения фоновых данных. В течение последующих 30 минут регистрируют СДА за каждый 5 минутный интервал времени. Анализ результатов проводят путем сравнения числа движений за 30 минут по отношению к фону в опытных и контрольной группах животных. Тестирование проводят в фоне и после окончания введения.
Исследование суммационной способности ЦНС
Фиксация крысы.
Настройка прибора, подающего на электроды прерывистый электрический ток, подготовка электродов.
Подведение электродов к задним конечностям крысы.
Определение порога возбудимости путем равномерного увеличения подаваемого напряжения со скоростью 1–2 В/сек (отдергивание лапки).
Регистрация напряжения тока.
Профилактика и выключение прибора.
Регистрация ЭКГ и артериального давления
Эксперименты проводят на ненаркотизированных животных.
Аппаратура. Полиграф RM-6000 (Япония), «Регистратор артериального давления» (Италия).
Процедура. Крыс помещают в специальные пеналы, у собак регистрацию проводят в станке. ЭКГ и артериальное давление (АД) регистрируют спустя несколько минут при стабилизации показателей. ЭКГ регистрируют во 2-ом стандартном отведении. АД регистрируют на хвосте крысы с помощью пьезоэлектрического датчика и манжетки соответствующего размера. До измерения АД животное на несколько минут помещают на термостатированную пластинку, обеспечивающую поддержание температуры в клетке в пределах
26–27°С. У собак АД регистрируют стандартным способом.
Патоморфологические исследования
Некропсия
Подготовка к вскрытию.
Наружный осмотр.
Состояние полостей и положение внутренних органов.
Макроскопическое исследование внутренних органов.
Гистологическое исследование
Подготовка фиксирующих жидкостей.
Отбор материала во время вскрытия.
Фиксация материала.
Вырезание кусочков фиксированного материала.
Уплотнение обезвоживание кусочков заливка в парафин.
Резка кусочков на замораживающем микротоме.
Резка блоков на санном микротоме.
Окраска замороженных срезов.
Окраска парафиновых срезов.
Просмотр гистологических препаратов.
Описание препаратов.
Микрофотосъемка изготовление отпечатков.
Статистическую обработку результатов исследования проводили по Стьюденту и Фишеру.
|
