Практикум по ветеринарной микробиологии

Скачать 3.35 Mb.

Название	Практикум по ветеринарной микробиологии
страница	3/27
Тип	Учебники и учебные пособия

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Учебники и учебные пособия

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 27

Тема 2. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

2.1. ФОРМА БАКТЕРИЙ

Морфология бактерий. Микроорганизмы имеют разнообразную форму и довольно сложную структуру, определяющую многообразие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны четыре основные формы: сферическая (кокковая шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая и нитевидная (рис. 12).

Шаровидные бактерии — кокки — в зависимости от плоскости делений и расположения относительно друг друга отдельных особей подразделяют на монококки (отдельно лежащие кокки), диплококки (парные кокки), стрептококки (цепочки кокков), стафилококки (скопления в виде виноградных гроздьев), тетракокки (образования из четырех кокков) и сарцины (скопления в виде пакетов из 8 или 16 кокков).

Палочковидные бактерии располагаются в виде одиночных клеток, дишто- или стрептобактерий. Ряд бактерий образуют споры, которые располагаются терминально, субтерминально или центрально; превышая поперечный размер клетки, споры придают ей веретенообразную форму. В зависимости от наличия и расположения в теле бактерии спор различают: бактерии, бациллы, клостридии и плектридии.

Извитые формы бактерий — вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спириллы — извитую форму с крупными и мелкими завитками.

Размеры бактерий колеблются от 0,1 до 1 мкм. В состав бактериальной клетки входят капсула, клеточная стенка, цитоплазма-тическая мембрана и цитоплазма, в которой находятся нуклеоид, рибосомы и включения (цв. рис. II).

Некоторые бактерии снабжены жгутиками и ворсинками. По типу расположения жгутиков бактерии делят на монотрихи, лофотрихи, амфотрихи и перитрихи (рис. 13)

Морфология спирохет. Спирохеты — извитые подвижные бактерии. Патогенные спирохеты принадлежат к трем родам:

Рис. 12. Основные формы бактерий:

/—монококки; 2 — диплококки; 3 — тет-ракокки; 4— стрептококки; 5 —стафилококки; 6— сариины; 7 — бактерии и стреитобактерш; S— плектрщши; д — клострияии; 10— вибрионы; 11 — спириллы; 12 — спирохеты.

Borrelia, Treponema, Leptospira.

Клетка спирохеты имеет цилиндрическую извитую форму, содержит цитоплазму, ограниченную цитоплаз-матической мембраной, снаружи которой расположена клеточная стенка со слабо-выраженным пептидоглика-новым слоем. Длина патогенных спирохет 3...20 мкм, толщина 0,1—0,5 мкм. Представители отдельных родов

отличаются по длине и толщине, числу и характеру завитков. Спирохеты грамотрицательны. Боррелии в отличие оттрепонем и лептоспир хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. Морфологию трепонем и лептоспир изучают путем микроскопии живых микроорганизмов в препаратах «раздавленная» или «висячая» капля с помощью темнопольного или фазово-контрастного метода, а также в мазках, окрашенных по Романовскому—Гимза или другими специальными методами.

Морфология риккетсий, хламидий и микоплазм. Риккетсии и хламидии являются облигатными внутриклеточными паразитами и представляют собой мелкие грамотрицательные микроорганиз-

Рис. 13. Типы бактерий в зависимости от расположения жгутиков:

/ — монополярные монотрихи;

2— монополярные лофотрихи;

J—биполярные моно- и ло-

фотри)(и; 4— перитрмхи

мы, характеризующиеся выраженным полиморфизмом: образуют кокковидные, палочковидные и нитевидные формы. Размеры рик-кетсий варьируют от 0,5 до 3...4 мкм, длина нитевидных форм достигает 10...40 мкм. Спор и капсул не образуют, окрашиваются по методу Здродовского в красный цвет.

Хламидии имеют шаровидную, овоидную или палочковидную формы. Их размеры колеблются в пределах 0,1 ...2,5 мкм. Морфология хламидии зависит от стадии их внутриклеточного цикла развития, который характеризуется превращением небольшого шаровидного элементарного образования в крупное инициальное тельце с бинарным делением. Перед делением частицы хламидии обволакиваются особой структурой, напоминающей бактериальную капсулу. Хламидии окрашиваются по методу Романовского—Гимза, грамотрица-тельны, хорошо видны в прижизненных препаратах при фазо-во-контрастной микроскопии.

Микоплазм ы отличаются от бактерий отсутствием клеточной стенки: вместо нее у них трехслойная липопротеидная ци-топлазматическая мембрана. Размеры микоплазм колеблются в пределах 125...250 мкм. Они имеют форму круглых, овальных или нитевидных образований, грамотрицательны.

Определение подвижности микроорганизмов.

Для определения подвижности бактерий применяют методы «висячая капля» и «раздавленная капля».

Метод «висячая капля». Каплю 18...20-часовой бульонной культуры или каплю конденсата агаровой культуры наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой), края которого слегка смазывают вазелином, накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло прилипло к предметному стеклу. Препарат перевертывают покровным стеклом вверх, и капля «висит» над луночкой (рис. 14).

Микроскопируют препарат в сухой системе объективов при слегка затемненном поле зрения (пользуются диафрагмой и опущенным конденсором). Под малым увеличением находят край капли, затем, приподняв тубус, переводят в рабочее состояние объектив среднего увеличения (40...60), осторожно,
под контролем глаза (смотреть сбоку) опускают тубус до соприкосновения фронтальной линзы объектива с покровным
стеклом. Затем, глядя в окуляр, осторожно поднимают
макрометрическим винтом тубус и находят в поле зрения
каплю. Далее микрометрическим винтом настраивают микроскоп до оптимальной видимости микробов. Рис. 14. Препарат «висячая капля.

Метод «раздавленная капля». На обычное предметное стекло наносят каплю суточной бактериальной культуры, осторожно накрывают покровным стеклом так, чтобы между стеклами не образовались пузырьки воздуха, а капля культуры не растеклась за края покровного стекла. Осторожно опускают объектив среднего увеличения и микроскопируют.

В обоих случаях на сероватом фоне поля зрения хорошо заметно движение микробных клеток.

Приготовление красителей и окраска мазков-препаратов. Методы пересева микроорганизмов.

Микроскопируют микробы в живом и неживом состоянии. Для изучения морфологических и тинкториаль-ных свойств микроорганизмов готовят специально окрашенный препарат, применяя для этого различные анилиновые красители.

Краски и красящие растворы. Наиболее часто в микробиологической практике используются следующие анилиновые краски: фуксин (основной), метиловый красный, нейтральный красный — в растворе имеют красный цвет; карболовый кристаллвиолет, ме-тилвиолет, генцианвиолет, готовая жидкая краска Гимза (азур-эозин) фиолетового цвета; метиленовая синь, бриллиантовая и малахитовая зелень.

Из сухих кристаллических или порошкообразных красителей готовят водные или спиртовые растворы красок. Последние обычно готовят впрок, так как они хорошо сохраняются в темноте (посуда из темного стекла, темное помещение). Для усиления действия красящих растворов на микробную клетку используют различные протравители, которые добавляют в раствор красителя (фенол, едкий калий) или ими обрабатывают препарат перед окрашиванием (слабые растворы соляной, серной или хромовой кислот). Также с целью протравливания препарат с налитой на него краской прогревают или заливают предварительно подогретым раствором краски. Краски, нестойкие в растворе, не сохраняющиеся длительное время, готовят только непосредственно перед употреблением в виде 1 ...2%-го раствора.

Спиртоводные растворы. Карболовый фуксин (фуксин Циля). Кристаллы основного фуксина предварительно растворяют в 96%-м этиловом спирте. Сначала готовят насыщенный спиртовой раствор (на 5...10 г краски 100 мл спирта). Для лучшего и более быстрого растворения кристаллы краски предварительно растирают в фарфоровой ступке в небольшом количестве спирта с добавлением нескольких капель глицерина. Чисто спиртовой раствор для окраски непригоден, поэтому готовят спиртоводный раствор: к 10...20 мл насыщенного спиртового раствора фуксина добавляют 100 мл дистиллированной воды с 5 % фенола (протрава). Полученный раствор фуксина фильтруют через фильтровальную бумагу. В ряде случаев фуксин Циля перед использованием разбавляют еще раз дистиллированной водой (1:10) и получают его рабочий раствор (фуксин Пфейффера).

Карболовый кристаллвиолет, метипвиолет, генцианвиолет. Первые два красителя в растворе очень быстро выпадают в осадок и при окрашивании могут исказить микроскопическую картину. Чаще используют генцианвиолет, который получают смешением метил- и кристаллвиолета с добавлением декстрина; он дает более ровное окрашивание. Для приготовления спиртоводного раствора 1 г сухого генцианвиолета растворяют в 10 мл спирта, растирая в ступке с глицерином и кристалликами фенола (2 %), затем добавляют дистиллированную воду. Чтобы избежать образования осадка при хранении раствора, листы фильтровальной бумаги пропитывают насыщенным спиртовым раствором краски, высушивают их на воздухе, нарезают мелкими полосками или квадратиками и сохраняют в темной банке с притертой пробкой.

При окраске препарата на него накладывают высушенную полоску с генцианвиолетом, сверху наливают несколько капель воды, выдерживая 2...3 мин.

Раствор метиленовой сини (щелочная синь Леффлера). Для приготовления раствора 3 г краски настаивают длительное время (3...4 мес) в 100 мл 96%-го спирта, затем 30 мл насыщенного раствора разбавляют в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 1 мл !%-го раствора едкого калия (протрава). Фильтруют.

Водные растворы. 2%-й сафранин: 2 г сухого красителя заливают 100 мл горячей дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр и сразу используют свежий раствор для окрашивания.

1%-й раствор малахитовой зелени: 1 г кристаллической краски растворяют в 100 мл горячей дистиллированной воды, фильтруют ее, остужают и используют для окрашивания.

Готовую жидкую краску азур-эозин (краска Гимза) применяют при специальных методах окрашивания бактерийных препаратов. Перед употреблением ее необходимо разбавить дистиллированной водой (1:10), но при этом сразу образуется осадок. Чтобы последний не влиял на препарат, окрашивание проводят, по рекомендации Романовского, следующим образом: на дно чашки Петри кладут стеклянные палочки или спички с обломанными головками, на них помещают препарат мазком вниз, раствор краски подливают под препарат (метод Романовского—Гимза).

Приготовление микроскопических препаратов.

Для микроскопического исследования с целью выявления форм микробов, их структурных и биохимических особенностей препарат готовят на предметном стекле. В качестве материала применяют взвеси бактерий; непосредственно бактериальную культуру, выросшую на жидкой или плотной среде; молоко, кровь, гной (препарат-мазок); ткани печени, селезенки или других органов (препарат-отпечаток, кляч-препарат).

Для приготовления препарата на рабочем столе должны быть: исследуемый материал (взвесь бактерий, микробные культуры, гной и др.), обезжиренные предметные стекла, бактериологическая петля, газовая (или спиртовая) горелка, бутыль с сифоном дистиллированной воды, сливная чашка с «мостиком», красители, фиксирующие и протравливающие жидкости.

Для приготовления препарата-мазка из жидкой микробной культуры (или гноя) в левую руку берут пробирку с материалом, в правую — бактериологическую петлю (как пишущее перо). Петлю тщательно прожигают на пламени горелки, не выпуская из рук, осторожно около пламени открывают пробирку свободными пальцами (мизинцем и безымянным) правой руки, петлей захватывают каплю материала, пробирку закрывают и ставят в штатив. Свободной левой рукой берут предметное стекло, наносят на его поверхность каплю и легкими круговыми движениями растирают по стеклу, затем препарат высушивают на воздухе (рис. 15), петлю прожигают.

Высохший препарат фиксируют (закрепляют) на стекле. Для этого чаще используют физический способ: препарат (обратной стороной мазка) 2—3 раза быстро проводят над пламенем горелки. Из фиксирующих химических средств применяют эфир, этиловый или метиловый спирт, формалин, смеси формалин-спирт и спирт-эфир. Для фиксации высушенный препарат помещают в стаканчик с фиксирующей жидкостью (или 1...2 капли жидкости наносят на препарат) и выдерживают 3...5 мин. Затем мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой. С обратной стороны стекла препарата восковым цветным карандашом обводят границу (зону) мазка, чтобы после окраски точно знать место его нахождения.

Для приготовления препарата из бактериальной культуры, выросшей на плотной среде, на предметное стекло петлей наносят каплю стерильного физиологического раствора, затем, прокалив петлю на огне, берут ею небольшое количество микробной массы из пробирки с поверхностного слоя (рис. 16) и аккуратно растирают в капле физиологического раствора на предметном стекле тонким равномерным слоем. В остальном поступают, как описано выше.

Пересев культур. При пересеве микробных культур из одной пробирки в другую обе пробирки удерживают в одной руке, как показано на рисунке 17. Последовательность действий изображена на рисунке 18. Посев уколом делают с использованием бактериологической петли, которую вводят в столбик плотной питательной среды (рис. 19).

Методы окрашивания микроорганизмов. Простой метод окраски. При данном методе используют только один краситель. На фиксированный препарат, помещенный на мостике над сливной чашкой, наливают раствор либо метиленовой сини (окрашивают 4...5 мин), либо карболовый фуксин Пфейффера <1...2мин), либо карболовый генцианвиолет (1...2мин). Краску

Рис. 15. Этапы приготовления мазка-препарата из микробной культуры (1...

S)

смывают водой из бутыли, препарат высушивают фильтровальной бумагой и наносят каплю иммерсионного масла. Готовый препарат помешают на предметный столик и микроскопируют.

Сложные (дифференцирующие) методы окраски. Отличаются от простых методов тем, что препарат окрашивают несколькими красками, а в отдельных случаях используют еще специальные реактивы (раствор Люголя, кислоты и др.). Сложные методы позволяют выявить наличие (или отсутствие) отдельных структурных элементов и некоторых органических соединений клетки, чем и определяют тинкториальные свойства каждого вида микроба.

Рис. 16. Отбор микробной массы с

поверхности плотной питательной

среды

Рис. 17. Пересев культур в пробирки с питательной средой

' Этапы пересева микробной культуры (/...6)

Рнс. 19. Посев уколом
Метод окраски по Граму. Фиксированный препарат окрашивают карболовым генцианвиоле-том в течение 2...3 мин. Не смывая водой, краску сливают и на 2...3 мин на препарат наносят раствор Люголя (йода кристаллического — 1 г; йодистого калия как растворителя йода — 2 г; дистиллированной воды — 300 мл). Раствор Люголя сливают; препарат, не промывая водой, обрабатывают 96%-м спиртом в течение ЗОс, затем хорошо промывают водой. После этого препарат дополнительно окрашивают рабочим раствором фуксина (до 1 мин), вновь промывают водой, сушат фильтровальной бумагой и микро-скопируют.

При окраске по Граму одни виды бактерий не обесцвечиваются спиртом после первичного окрашивания и сохраняют фиолетовый цвет; их называют грамположительными. Другие виды обесцвечиваются спиртом, а затем воспринимают дополнительную окраску фуксином и приобретают розово-красный цвет; их называют грамотрицательными (цв. рис. III). Окрашивание по Граму обусловлено структурными особенностями клеточной стенки у грам-положительных и грамотрицательных групп микробов, длиной и формой ее пор, неодинаковым химическим составом и строением пептндогликанового слоя клеточной стенки микроорганизмов. Генцианвиолет (или кристаллвиолет) и нуклеиновые кислоты цитоплазмы в присутствии йода (раствор Люголя) образуют прочный комплекс, нерастворимый в воде и слаборастворимый в спирте. Поэтому при действии спиртом в течение 30 с бактерии с многослойным пептидогликановым каркасом (грамположителъные) не обесцвечиваются. У грамотрицательных бактерий пептидоглика-новый слой имеет более крупные поры, что облегчает прохождение спирта; образовавшийся комплекс разрушается, клетка обесцвечивается.

Методы окраски кислота-, спирте-, щеяочеустойчивых бактерий. Микробы данной группы (микобактерии туберкулеза, парату-беркулезного энтерита крупного рогатого скота, проказы человека и др.) принадлежат к грамположительным бактериям. Для их дифференциации применяют специальные методы окрашивания, основанные на различной химической структуре цитоплазмы и клеточной оболочки. В состав этих бактерии входит значительное количество жировосковых веществ, в частности стеариновых кислот (в том числе фтионовой кислоты до 40%), поэтому они трудно воспринимают краски. Но если они окрасились при воздействии протравителя, то трудно уже обесцвечиваются кислотами, спиртами и щелочами.

Наиболее распространенным метолом окраски бактерий данной группы является метод Циля—Нильсена. На фиксированный препарат кладут кусок белой фильтровальной бумаги (для предохранения от осадка), на него наливают раствор карболового фуксина, снизу препарат подогревают над пламенем до появления паров и оставляют на «мостике» (5...7 мин). Затем краску с бумажкой сливают (не промывая) и обесцвечивают 3...5%-м раствором серной кислоты (5...7 с), хорошо промывают водой и дополнительно окрашивают метиленовой синью Леффлера (4...5 мин). Далее препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Кислотоустойчивые (спирто-щелочеустойчивые) бактерии окрашиваются в красный цвет (не обесцвечиваются кислотой), а некислотоустойчивые — в синий, так как легко окрасившись фуксином, они легко обесцвечиваются кислотой и воспринимают вторичную окраску синью.

Методы окраски непостоянных элементов микробной клетки. В структуре микробной клетки различают постоянные и непостоянные элементы. Постоянные — это цитоплазма, оболочка, ядерное вещество; непостоянные — спора, капсула, жгутики, которые при определенных условиях формируются лишь у бактерий отдельных видов, поэтому служат видовым признаком.

Окраска спор. Палочковидные микробы, образующие во внешней среде (почве, воде, кормах, на питательных средах) стойкую форму существования — спору, называют бациллами. При спорообразовании в клетке происходят процессы, обусловливающие сгущение цитоплазмы, уменьшение свободной воды (до 40 %). Цитоплазматическое содержимое покрывается многослойными оболочками, химический состав которых обеспечивает высокую стойкость споры к нагреванию, высушиванию, действию многих кислот, шелочей, красителей. При законченном спорообразовании спора лежит свободно, без остатков вегетативной клетки; при незаконченном процессе спора, в зависимости от вида микроба, располагается либо в центре клетки, либо на конце (терминально), либо между концом и центром клетки (субтерминально). При микроскопировании препаратов, окрашенных простым методом или по Граму, видна окрашенная вегетативная часть клетки и неокрашенные, хорошо преломляющие свет споры.

Метод Ауески. Высушенный на воздухе препарат, не фиксируя, протравливают 0,5%-й соляной кислотой с подогреванием (2...3 мин), охлаждают, промывают водой и фиксируют над пламенем. Затем на препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, наливают на него карболовый фуксин Циля, окрашивают с подогреванием до паров (7...8 мин), краску сливают, препарат обрабатывают 5%-м раствором серной кислоты (5...7с), хорошо промывают водой. Дополнительно окрашивают метиленовой синью (4...5 мин), опять промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. Микроскоп ируют под иммерсией: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные (цв. рис. IV).

Метод Меллера. Фиксированный на пламени препарат протравливают 5%-й хромовой кислотой (2...3мин), промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой. Далее поступают, как в предыдущем методе. Результат окраски тот же: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Златогорова. Процесс окраски, как в предыдущих двух методах, только без протравы. После окрашивания вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Пешкова. Мазок фиксируют, красят метиленовой синью с подогреванием до кипения, смывают. Докрашивают 1%-м водным раствором нейтральрота (10 с), смывают, просушивают. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в красный.

Окраска капсул. Капсула — производное наружного слоя оболочки. Представляет собой мупиноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид. У патогенных капсулообразу-юших бактерий наличие капсулы наблюдают только в инфицированном организме как защитное приспособление против фагоцитоза (на искусственных питательных средах капсулы образуются лишь при добавлении кровяной сыворотки или дефибринирован-ной крови). Капсулообразование отмечают у возбудителей сибирской язвы, злокачественного отека, диплококковой септицемии. Капсульное вещество плохо окрашивается, поэтому для его выявления применяют специальные методы окраски, основанные на явлении метахромазии.

Метод Михина. Фиксированный мазок из крови или препарат-отпечаток из ткани органа (печени, селезенки, почки) окрашивают метиленовой синью с подогреванием до появления паров (5...7 мин). Краску сливают, быстро промывают водой (можно не промывать), просушивают фильтровальной бумагой. Микробная клетка окрашивается в синий цвет, капсула — в светло-розовый.

Метод Романовского—Гимза. Фиксированный препарат окрашивают, как было указано выше: мазок-препарат помещают в чашку Петри на стеклянные или деревянные палочки отпечатком вниз, под препарат подливают краску, окрашивают 40...50 мин. Результат тот же, что и при окраске по Михину: микробная клетка окрашивается в синий цвет, капсула — в светло-розовый.

Метод Ольта. Свежий водный 2%-й раствор сафранина наливают на препарат и выдерживают 5...7 мин. Затем слегка промывают водой и высушивают. Вегетативная клетка — кирпично-красного цвета, капсула — желто-оранжевого.

Приготовление мазков из крови и окраска спирохет. На чистое обезжиренное стекло, ближе к одному из его концов, нанести каплю крови. Другое предметное стекло со шлифованным краем прижать под углом 45° к капле крови, а затем скользящим движением передвинуть его к другому концу нижнего стекла. При этом кровь распределится по предметному стеклу тонким слоем. Высушить препарат на воздухе, зафиксировать в жидком фиксаторе (метиловый спирт или смесь этилового спирта и эфира).

Окрасить препарат по методу Романовского— Гимза (смесь ме-тиленового синего, эозина и азура). На мазок нанести рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10...20 мин. Затем препарат промыть водой и высушить на воздухе.

Лептоспиры окрашены в розово-сиреневатый, эритроциты крови — в розовый, ядра лейкоцитов — в фиолетовый цвет.

Окраска ршкетсий по методу Здродовского. Окрашивать мазок разведенным фуксином Циля (10...15 капель на 10 мл дистиллированной воды) в течение 5 мин, промыть водой. Обработать мазок 0,5%-м раствором лимонной кислоты или 0,01%-м раствором хлороводородной кислоты, промыть водой. Окрасить метиленовой синью в течение 1 мин, промыть водой и высушить препарат.

Риккетсии, окрашенные по методу Здродовского, — красного цвета, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют, — голубая, ядра — синие.

Жгутики имеются только у подвижных видов бактерий. Они очень тонкие (менее разрешающей способности микроскопа), окрашиваются плохо, поэтому при световой микроскопии к окраске жгутиков прибегают редко. Чаще бактерий исследуют в живом состоянии (без окраски), определяя их подвижность. У разных видов число и расположение жгутиков неодинаковое (см. рис. 13).