Литература медицинских вузов для студентов руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии

Тема 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ Введение. Идентификация — определение (установление) ви­довой принадлежности микроба. В настоящее время общепри­нятый метод идентификации основан на изучении определен­ного набора наиболее важных фенотипических признаков ис­следуемого микроорганизма. Критерием для идентификации является наличие у микроба совокупности основных призна­ков, характерных для данного вида (таксонометрических при­знаков). Установление вида производится согласно междуна­родной таксономии бактерий (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology). К основным видовым признакам бактерий относятся: морфология микробной клетки; тинкториальные свойства — особенности окрашивания с помощью простых и сложных методов окраски; культуральные признаки — особенности роста микроба на питательных средах; биохимические признаки — наличие у бактерий фермен­тов, необходимых для синтеза или расщепления (фер­ментации) различных химических соединений. В бактериологической практике чаще всего изучают сахаро-литические и протеолитические ферменты. К дополнительным признакам, используемым при идентифи­кации, относятся: наличие видоспецифических антигенов (см. главу 10); чувствительность к видоспецифическим бактериофагам (см. главу 5); видовая резистентность к определенным антимикробным препаратам (см. главу 8); для патогенных бактерий — продукция определенных факторов вирулентности (см. главу 9). Тонкая внутривидовая идентификация до биовара (серова-ра, фаговара, ферментовара и т.д.) — типирование — основана на выявлении соответствующего маркера: антигена (серотипи-рование, см. главу 10), чувствительности к типовому бактери­офагу (фаготипирование, см. главу 5) и др. В последние годы разработаны и начали применяться со­временные биохимические и молекулярно-биологические ме­тоды идентификации: хемоидентификация, анализ нуклеино­вых кислот: рестрикционный анализ, гибридизация, полиме-разная цепная реакция (ПЦР), риботипирование и др. План занятия Программа Идентификация бактерий. Изучение биохимических свойств аэробных и ана­эробных бактерий. а Демонстрация Незасеянный "пестрый ряд". Варианты изменения "пестрого ряда". "Пестрый ряд" для анаэробных бактерий. Микрометод изучения биохимических свойств бакте­рий. Рост бактерий, вырабатывающих пигменты. Задание студентам Зарисовать варианты изменения "пестрого ряда". Оценить результаты отсева чистой культуры: отметить наличие или отсутствие роста посеянной культуры, а также присутствие посторонних бактерий. Убедиться в чистоте выделенной культуры, для этого приготовить мазок и окрасить его по методу Грама. Поставить каталазную пробу на стекле и оценить ее результат. Учесть результаты определения биохимической актив­ности выделенных чистых культур. С помощью таблицы-определителя на основании изу­ченных морфологических, тинкториальных, культуральных и ферментативных свойств идентифициро­вать выделенные микробы. Методические указания Биохимическая идентификация. Для оценки биохимической активности бактерий используют следующие реакции: 1) ферментацию — неполное расщепление субстрата до промежуточных продуктов, например ферментацию угле­водов с образованием органических кислот; окисление — полное расщепление органического суб­страта до СО2 и Н2О; ассимиляцию (утилизацию) — использование субстрата для роста в качестве источника углерода или азота; диссимиляцию (деградацию) субстрата; гидролиз субстрата. Классический (традиционный) метод идентификации мик­робов по биохимическим признакам заключается в посеве чис­той культуры на дифференциально-диагностические среды, со­держащие определенные субстраты, с целью оценки способ­ности микроорганизма ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. Исследова­ние занимает не менее 1 сут. Примером является оценка саха-ролитической активности бактерий (способности ферментиро­вать углеводы) с помощью посева на среды Гисса — короткий и длинный "пестрый ряд". Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда". Корот­кий "пестрый ряд" включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом — маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнооб­разными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галак­тоза и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). Для оценки способности бактерий ферментировать углевод в среды добавляют индикатор (реактив Андреде или др.), позволяющий выявить образование кислых продуктов расщепления (органи­ческих кислот), и "поплавок" для обнаружения выделения СО2. Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают пет­лей в среды "пестрого ряда". Посевы инкубируют при 37 "С в течение 18—24 ч или больше. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, на­блюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистриру­ется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом" (рис. 3.2.1; на вклейке). Для определения протеолитических ферментов производят посев культуры бактерий уколом в столбик 10—20 % желатина, пептонную воду. Посевы в желатине инкубируют при 20—22 °С в течение нескольких дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин, образуя фигуру, на­поминающую воронку или елочку. В посевах в пептонную воду определяют продукты расщеп­ления аминокислот после инкубирования в течение 2—3 сут при 37 °С путем постановки реакций на аммиак, индол, серово­дород и др. Реакция на аммиак. Узкую полоску лакмусовой бу­маги укрепляют под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. Посинение бумаги свидетельствует об образовании аммиака. Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с куль­турой бактерий прибавляют 2—3 мл эфира, содержимое энер­гично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида с хлористоводородной кислотой). В присутствии индола наблю­дается розовое окрашивание, при осторожном наслаивании образуется розовое кольцо (см. рис. 3.2.1). Реакция на сероводород. В пробирку с пептонной водой помещают узкую полоску фильтровальной бумаги, смоченную сульфатом железа, и закрепляют ее под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. При выделении серо­водорода образуется нерастворимый сульфид железа (FeS), ок­рашивающий бумагу в черный цвет (см. рис. 3.2.1). Продукцию H2S можно определять также путем посева культуры бактерий уколом в столбик с питательной средой, содержащей реактивы для выявления b^S (смесь солей: сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия). Положительный результат — среда приобретает черный цвет за счет образования FeS. Обнаружение каталазы. На предметное стекло нано­сят каплю 1—3 % раствора пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Выделение пузырьков газа свидетельствует о наличии у данного вида бактерий ката­лазы. В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если этого достаточно для их иденти­фикации. При необходимости исследуют другие признаки, на­пример способность к восстановлению нитратов, карбоксили-рованию аминокислот, образованию оксидазы, плазмокоагула-зы, фибринолизина и других ферментов. Результаты работ по идентификации выделенной культуры протоколируют (табл. 3.2.1). Биохимические тесты 2-го поколения, основанные на при­менении концентрированных субстратов и более чувствитель­ных методов обнаружения конечных продуктов реакции, по- Морфо- Окраска Характер Биохимические свойства Наимено- логия по методу роста вание Грама 1 1 1 рода и ферментация обра- вида зова- ние и £ н- ч '§|&3:зЗЙ£з |1е § з а § 1 1 § §юя 2 й а 1 к 1 р SSSBgslslS водных). Это позволяет различать микробы, принадлежащие к разным видам, по количественному и качественному со­ставу липидов (жирных кислот, эфиров, спиртов, хинонов и т.д.). Анализ химического состава микробных клеток осу­ществляется с помощью метода хроматографии. Наиболее широко используют метод газожидкостной хроматографии. Ведущей областью применения метода являются идентифи­кация анаэробных бактерий по составу жирных кислот с короткой углеродной цепью (9—20 атомов углерода), относя­щихся к основным продуктам метаболизма этих микроорганиз­мов, а также идентификация медленно растущих бактерий (микобактерий) и бактерий с низкой ферментативной актив­ностью. Молекулярно-генетические методы идентификации. Они ос­нованы на анализе бактериальных ДНК. Рестрикционный анализ. ДНК обрабатывают рестрикционными ферментами — специфическими эндонуклеазами, которые разрезают молекулу ДНК по определенным по­следовательностям нуклеотидов. Далее проводят анализ полу­ченных фрагментов, уникальных для каждого вида микроорга­низма. Метод также позволяет осуществлять внутривидовое типирование бактерий. Гибридизация ДНК. Любой микроорганизм имеет в своем геноме определенные уникальные последовательности, которые могут быть использованы для его идентификации. Метод обнаружения таких участков ДНК основан на способ­ности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. Исследование проводят с помощью нуклеиновых зондов — однонитевых фрагментов ДНК, ком­плементарных уникальным участкам микробного генома и не­сущих метку (радионуклид, фермент или флюорохром). Вклю­чение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-, видо- или типоспецифическими. Быстрота и высокая чувствительность метода гибридизации позволяют существенно сократить время исследования. Основной облас­тью применения является идентификация трудно культивиру­емых или медленно растущих микробов (например, представи­телей родов Mycobacterium, Neisseria, Campy lobacter). Особо сле­дует выделить метод риботипирования — идентификации, осно­ванной на анализе генов, кодирующих рибосомальные РНК. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные последовательности ДНК, присутствующие в образце в очень малых количествах. Теоретически достаточно одной копии искомой последователь­ности. Метод ПЦР основан на амплификации (увеличении числа копий) искомого участка генома микроорганизма. С этой целью образец инкубируют в буферном растворе с двумя ко­роткими ДНК-олигомерами (праймерами), комплементарны­ми концам известного фрагмента генома, термостабильной ДНК-полимеразой и нуклеотидами. После гибридизации олигомеров с комплементарными участками ДНК они служат праймерами для полимеразы, которая копирует искомый фраг­мент. Образец многократно нагревают для разделения цепей двойной спирали ДНК и остужают для повторной гибридиза­ции праймеров с комплементарной матрицей. Каждая копия ДНК становится новой матрицей для синтеза новой копии. Процедуру повторяют 20—40 раз. При этом количество копий искомого фрагмента генома увеличивается по экспоненциаль­ному закону. Амплификация в миллионы раз занимает всего несколько часов. Глава 4 МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ГРИБОВ Введение. Грибы представляют собой многочисленную груп­пу микроорганизмов, относящихся к доминиону Eukarya, цар­ству Mycota. Классификация внутри царства основана на мор­фологии, характере и способах размножения, физиологических особенностях и других признаках. Клетка гриба имеет ультра­структуру, типичную для эукариот. Все грибы способны к бесполому размножению, совершенные грибы могут также раз­множаться половым путем. Представители одного вида в по­ловой (телеоморфной) и бесполой (анаморфной) фазах разви­тия могут существенно различаться по морфологии, экологии и в случае патогенных видов способности вызывать заболева­ния. Грибы подразделяются на две основные морфологические группы: плесени (нитевидные грибы) и дрожжи. Морфология плесневых грибов. Вегетативное тело плесневого гриба — гифа — имеет нитевидную форму. Толщина гиф обыч­но превышает 2 мкм, что позволяет отличить их от актиноми-цетов, толщина клеток которых не превышает 1 мкм. Длина гиф у свободно живущих видов может достигать нескольких метров. У высших грибов гифа разделена мембранными пере­городками — септами, у низших септы отсутствуют. Гифы в процессе развития ветвятся и образуют анастомозы, за счет чего формируется переплетенная структура — мицелий. Разли­чают субстратные гифы (мицелий), погруженные в питатель­ный субстрат, и воздушные, растущие над его поверхностью. Плесневые грибы размножаются преимущественно путем образования вегетативных (бесполых) спор, которые у предста-Род Мицелий Вегетативные споры вегетатив- репродук- тип расположение ный тивный Мисог Несепти- Несепти- Эндо- В спорангии рованный рованный споры споран-гиеносец Asper- Септиро- Несепти- Экзо- Свободное на В виде gillus ванный рованный споры концах ответ- "лейки" конидие- (кони- влений репро-носец дии) дуктивных гиф Penicil- To же Септиро- То же В виде Пит ванный "кисто-конидие- чек" носец параты раздавленная" капля из чистых культур гри­бов родов Penicillium, Aspergillus, Mucor. Питательные среды для культивирования грибов. Рост и типы филаментации дрожжеподобных грибов рода Candida на картофельном агаре. Изучение биохимических признаков чистой культуры грибов рода Candida ("пестрый ряд"). Задание студентам Микроскопировать и зарисовать мазки, предложен­ные для демонстрации. Ознакомиться с таблицами. Описать характер роста грибов рода Candida на глюкозокартофельном агаре. Указать тип филаментации (по данным таблицы "Бластоспоры и филаментация дрожжеподобных грибов"). Проанализировать "пестрый ряд" чистой культуры грибов рода Candida, сверяя полученные результаты с данными таблицы "Таксономические признаки дрож­жеподобных грибов рода Candida", и сделать заклю­чение о видовой принадлежности. а Методические указания Морфологию грибов изучают в нативных и фиксированных препаратах. Для приготовления нативного препарата "раздав­ленная капля" для изучения морфологии плесневых грибов отделяют препаровальными иглами небольшой участок мице­лия с плодоносящими гифами и прилегающим к нему тонким слоем питательной среды. Материал помещают в каплю воды на предметном стекле, иглой расправляют мицелий, придавли­вают покровным стеклом и микроскопируют при опущенном конденсоре. Препарат просматривают с объективом 8х, а затем — 40х. Предварительно колонии или культуры грибов микроскопируют непосредственно на чашках или в пробирках под малым увеличением. Методы культивирования грибов аналогичны бактериологи­ческим. Грибы выращивают на специальных сложных пита­тельных средах (среда Сабуро, сусло-агар, картофельные, мор­ковные среды и др.), включающих углеводы в качестве источ­ника энергии и углерода и различные факторы роста. Для приготовления таких сред обычно используют натуральные добавки: дрожжевой экстракт, пивное сусло, овощные экстра­кты и др. Для задержки роста бактерий добавляют антибиотики и/или молочную кислоту. Среда Сабуро состоит из дрожжевой воды с добавлением 1 % пептона, 2 % агара и 4 % мальтозы (или глюкозы). Питатель­ную среду разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин. В жидкие среды агар не добавляют. Этапы выделения чистых культур грибов (из организма больного или объектов внешней среды) те же, что и при выделении бактерий. Исследуемый материал засевают на спе­циальные жидкие обогатительные (для накопления в случае малой концентрации микроорганизмов) или плотные питатель­ные среды для получения изолированных колоний и инкуби­руют в термостате при температуре 37е и 28—30 'С в течение нескольких дней. Рост грибов наблюдается на 3—5-е сутки. На плотных средах формируются разнообразные колонии: плос­кие, выпуклые, гладкие, морщинистые, мучнистые, слизистые, пушистые и др., часто пигментированные. Так, дрожжеподоб-ные грибы рода Candida на 2—3-й день после посева образуют мелкие выпуклые пигментированные колонии с гладкой блес­тящей поверхностью, которые нередко сливаются и врастают в питательную среду. Делают пересев колоний, выделяют чис­тую культуру и проводят идентификацию с определением ро­довой и видовой принадлежности на основании морфологи­ческих, культуральных, биохимических и других признаков. Методы идентификации грибов аналогичны методам иденти­фикации бактерий. Особое значение для определения видовой принадлежности чистой культуры плесневых грибов имеет изу­чение их морфологии. Для определения культуральных призна­ков колонии грибов микроскопируют непосредственно на чаш­ках или в пробирках под малым увеличением. Биохимические свойства можно определить с помощью "пестрого ряда" или другими методами (см. тему 3.2). Глава 5 ОБЛИГАТНЫЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПАРАЗИТЫ Введение. К облигатным внутриклеточным паразитам отно­сятся все вирусы и некоторые бактерии (представители поряд­ков Chlamydiales и Rickettsiales), а также ряд видов патогенных простейших (Toxoplasma, Plasmodium и др.). Вирусы выделены в самостоятельное царство Vira. Вирусы не имеют клеточного строения, собственного метаболизма, содержат один тип нук­леиновой кислоты — ДНК или РНК, не размножаются бинар­ным делением и могут кристаллизоваться как неорганические вещества. Они являются облигатными внутриклеточными па­разитами с дизъюнктивным (разобщенным) типом размноже­ния. Внеклеточная форма существования вируса называется вирионом. В отличие от организмов, имеющих клеточное строе­ние, вирусы занимают промежуточное положение между живой и неживой материей. В основе классификации вирусов лежат определенные признаки: тип вирусной нуклеиновой кислоты — ДНК-содержащие и РНК-содержащие; тип симметрии капсида — изометрический (кубический), спиральный или смешанный; наличие или отсутствие суперкапсида — просто или сложно устроенные; тип хозяина — вирусы человека и животных, растений, бактерий (бактериофаги).

Похожие:

	Литература для студентов медицинских вузов акушерство Рекомендовано Департаментом научно-исследовательских и образовательных медицинских учреждений Министерства здравоохранения Российской...		Рабочая программа учебной дисциплины клиническая иммунология и аллергология... Рабочая программа составлена на основании: Программы по микробиологии, вирусологии, иммунологии для лечебных, медико-профильных и...
	Рабочая программа учебной дисциплины клиническая иммунология Для... Рабочая программа составлена на основании: Программы по микробиологии, вирусологии, иммунологии для лечебных, медико-профильных и...		H. В. Прозоркина, П. А. Рубашкина Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии Санитарно-микробиологическое исследование объектов окружающей среды в лечебно-профилактических учреждениях
	Литература в библиотеке ми пгу основная литература Детские болезни А. А. Бар Пропедевтика детских болезней Мазурин 2001г 1 шт. – читальный зал Баранова, Г. А. Лыскиной для студентов...		Учебник для студентов медицинских вузов Учебник содержит тестовый контроль знаний по психотерапии и список рекомендуемой литературы. Для студентов медицинских вузов и врачей...
	Учебник для вузов Рекомендовано Учебно-методическим объединением... Дудникова Э. В. — профессор кафедры детских болезней по ростовского государствен­ного медицинского университета, доктор медицинских...		Руководство к лабораторным занятиям по гигиене детей и подростков... Учебное пособие предназначено для студентов медицинских вузов по специальности «Лечебное дело» ипрактикующих врачей
	Коркина М. В. К66 Психиатрия: Учебник для студ мед вузов / М. В.... Учебник предназначен для студентов медицинских вузов, работаю­щих психиатров, психотерапевтов, медицинских психологов и специали­стов...		И стерилизация Рецензенты: доц каф микробиологии, вирусологии и иммунологии, канд мед наук Н. Ф. Казак; зав лабораторией индикации возбудителей...
	Неинфекционные заболевания кожи учебно-методические указания к практическим... Зав кафедрой дерматовенерологии гбоу впо «Кубгму» Минздрава России, профессор, д м н		Литература для студентов медицинских вузов (авторы) сборник тестов по биохимии В сборнике представлены тесты по биохимии, составленные в полном соответствии с теоретическим материалом по курсу «Биохимии», рекомендованному...
	Практических занятий по медицинской микробиологии Руководство по организации и проведению практических занятий по медицинской микробиологии /Под ред акад. Рамн о. В. Бухарина. Екатеринбург,...		Учебник для медицинских вузов и медицинских специалистов Серия «xxi век» Учебник предназначен для студентов медицинских муювi-ii курсов, продолжающих изучение английского языка
	Руководство по статистическому анализу деятельности лечебно-профилактических учреждений Руководство предназначено для руководителей органов и учреждений здравоохранения, врачей всех клинических специальностей, врачей-статистиков...		Руководство состоит из двух частей. Часть первая «Общая онкология» Руководство предназначено для нефрологов, врачей-терапевтов, студентов старших курсов медицинских вузов, а также клинических интернов...