Литература медицинских вузов для студентов руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии
|
Скачать 3.52 Mb.
|
|
Тема 6.1. МОДИФИКАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ, МУТАЦИИ, РЕКОМБИНАЦИЯ И ПЕРЕНОС ГЕНОВ МЕЖДУ БАКТЕРИЯМИ План Программа Способы сохранения генетической информации у микробов. Модификационная изменчивость. Мутационная изменчивость. Рекомбинация ДНК. Способы передачи генетической информации между бактериями — трансформация, трансдукция, конъюгация. Фаговая конверсия. Сохранение и изменение генетической информации в микробных популяциях. Демонстрация S- и R-формы колоний у E.coli. Таблицы со схемами передачи генетической информации между бактериями в опытах трансформации, трансдукции и конъюгации. Задание студентам Определить частоту образования рекомбинантов Leu+ в опыте конъюгации. Определить частоту образования трансдуктантов (рекомбинантов) в опыте трансдукции фагом A, dgai Определить частоту образования трансформантов (рекомбинантов) в опыте трансформации признака Strr (стрептомицинрезистентности) у Bacillus subtilis. Методические указания Постановка опыта трансформации (рис. 6.1; на вклейке). Реципиент — штамм Bacillus subtilis Str5 (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину); донор — ДНК, выделенная из штамма B.subtilis Strr (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) — питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина. К 1 мл бульонной культуры B.subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора. Смесь инкубируют при 37 "С в течение 30 мин. Затем в пробирку вносят смесь 0,1 мкг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл раствора хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдерживают в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов (трансформантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры в изотоническом растворе хлорида натрия готовят 10-кратные разведения до 10~5— 10~6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля — на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину. Посев инкубируют при 37 °С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинант-ных клеток к числу клеток реципиентного штамма. Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10~5 выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси — 68 колоний рекомбинантного штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клеткой, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170хЮ5 жизнеспособных клеток, а в 1 мл — 170хЮ6, или 1,7х108. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинант-ных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8x10^. Таким образом, частота трансформации в данном опыте будет равна: Постановка опыта специфической трансдукции (рис. 6.2; на вклейке). Реципиент — штамм E.coli lac, лишенный (3-галакто-зидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг — фаг Я. dgal, в геноме которого часть генов замещена р-галактозидазным опероном E.coli. Он является дефектным, т.е. не способен вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг dgal) с названием содержащегося в его геноме бактериального оперона gal. Селективная среда — среда Эндо, на которой лактозоотрицательные бактерии реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозо-положительные колонии рекомбинантного штамма приобретают красный цвет с металлическим оттенком. К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага dgal в концентрации 106—107 частиц в 1 мл. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 60 мин, после чего готовят ряд 10-кратных разведений (в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчитываемого количества колоний. Из пробирки с разведением 10~6 делают высев по 0,1 мл культуры на 3 чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение 1 сут, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют частоту трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма. Например, после посева 0,1 мл смешанной культуры в разведении 10"~6 на 3 чашках со средой Эндо выросло соответственно 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, на первой и последней чашках — 5 и 1 колонии трансдуктантов красного цвета. Следовательно, частота трансдукции в этом случае будет равна: (5+1) х 10xlO= 6 2 (38+170+160) х 10х10б 468 ' Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, который содержит ген leu, контролирующий синтез лейцина (рис. 6.3; на вклейке). Донор — штамм E.coli K12 Hfr leu+ Str5; реципиент — штамм E.coli K12F~ leu+ StrR. .Hfr — обозначение состояния, для которого характерна высокая частота рекомбинации. Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая среда: КН^РС^ — 6,5 г, MgSO4 - 0,1 г, (NH4)2S04 - 1 г, Ca(NO3)2 - 0,001 г, FeSO4 -0,0005 г, глюкозы — 2 г, стрептомицина — 200 ЕД/мл, дистиллированной воды — 1 л. К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10~2—10~3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают донорныи и реципиентныи штаммы, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру донорного штамма высевают на селективную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма — на полную среду (питательный агар) с антибиотиками для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным. Например, после посева 0,1 мл смеси донорных и реципиентных культур в разведении 10~2 выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципиента из разведения 10~6 — 75 колоний. Таким образом, частота рекомбинации будет равна: 150 х 10 х 100 _ 1,5 х 10s _4 75х10хЮ6 ~7,5хЮ8 ' ' Глава 7 МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ АНТИСЕПТИКОВ И ДЕЗИНФЕКТАНТОВ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ Введение. Уничтожение патогенных для человека микробов является одной из важнейших проблем в профилактике и лечении различных заболеваний. Для борьбы с микробами используют методы асептики, антисептики, дезинфекции и антимикробной терапии. Каждый метод имеет свои особые цели и условия применения. Тема 7.1. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ И ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ Введение. Асептика — система мероприятий, предупреждающих внесение (попадание) микроорганизмов из окружающей среды в ткани или полости человеческого организма при лечебных и диагностических манипуляциях, а также в материал для исследования, в питательные среды и культуры микроорганизмов при лабораторных исследованиях. Асептика предусматривает соблюдение особых санитарно-гигиенических правил и приемов работы, а также специальную обработку инструментов, материалов, рук медицинских работников, помещений и т.д. с целью частичного (дезинфекция) или полного (стерилизация) уничтожения микробов. Антисептика — комплекс лечебно-профилактических мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов, способных вызвать инфекционный процесс, на поврежденных участках кожи и слизистых оболочек, путем обработки микро-бицидными веществами — антисептиками. Стерилизация — полное уничтожение микроорганизмов, включая вегетативные формы и споры. Существуют 3 основные группы методов стерилизации: физические, механические и химические. Выбор метода, используемого для решения практической задачи, зависит от стерилизуемого объекта. Дезинфекция — обеззараживание объектов окружающей среды. В отличие от стерилизации дезинфекция приводит к гибели большинства, но не всех форм микробов и, таким образом, обеспечивает только снижение микробной контаминации (загрязнения), а не полное обеззараживание объекта. Поэтому предметы, подвергшиеся дезинфекции, не являются абсолютно безопасными. План Программа Асептика, антисептика и дезинфекция. Антисептики и дезинфектанты. Антимикробное действие физических и химических факторов. Методы стерилизации; аппаратура, используемая для стерилизации. Методы контроля эффективности стерилизации, действия антисептических и дезинфицирующих веществ. Демонстрация 1. Аппаратура, используемая при стерилизации: автоклав, сушильный шкаф, аппаратура для фильтрации и УФ-облучения. Задание студентам Учесть результаты опытов, поставленных с бактериальными тест-объектами для контроля эффективности стерилизации, проведенной путем кипячения и автоклавирования. Сделать заключение. Определить по готовым посевам антибактериальное действие УФ-лучей на стафилококки и кишечную палочку. Учесть результаты опытов, поставленных для определения антимикробного действия антисептических и дезинфицирующих веществ. Сделать заключение. Методические указания • Методы стерилизации I. Физические методы. Воздействие высоких температур. Высокая температура обладает микробицидным действием благодаря способности вызывать денатурацию важнейших биополимеров, в первую очередь белков. Стерилизация сухим жаром в сушильно-стерилизационном шкафу (печи Пастера) основана на бактерицидном действии нагретого до 165—170 °С воздуха в течение 45 мин. При более высокой температуре происходит обугливание ватных пробок, бумаги, в которую завернута посуда, а при более низкой температуре требуется большой срок стерилизации. Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду (чашки Петри, пробирки, пипетки и др.).
меняют ограниченно, например для стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл, пинцетов. Воздействие ионизирующих излучений. Микроби-цидное действие ионизирующих излучений основано на их способности вызывать повреждения в молекуле ДНК. Для стерилизации одноразовых медицинских инструментов и бактериологического оборудования, чувствительного к термическим воздействиям (пластиковая посуда для культивирования микробов и клеточных культур, пластиковые шприцы, системы переливания крови и т.д.), обычно применяют стерилизацию у-изл учением. II. Механические методы. Основаны на фильтровании через специальные мембранные фильтры с малым размером пор, способные механически задерживать микроорганизмы. В лабораторной практике широко применяют бумажные и полимерные фильтры. Существуют фильтры с порами различных, строго откалиброванных размеров, что позволяет гарантированно очищать материал не только от бактерий, но и вирусов, а при необходимости и от некоторых макромолекул. Фильтрование используют для стерилизации жидких материалов, не выдерживающих нагревания (сыворотка крови, растворы антимикробных препаратов, компоненты питательных сред для бактерий и культур клеток), для получения бактериальных токсинов и других продуктов жизнедеятельности бактерий. Фильтрование является ведущим методом стерилизации воздуха в тех случаях, когда это необходимо. Для этого воздух пропускают через фильтры, пропитанные микробицидными веществами. Такие системы стерилизации применяют, например, в настольных боксах для работы с возбудителями особо опасных инфекций, а также в операционных блоках, родильных отделениях и т.д. III. Химические методы. Основаны на обработке объекта химическими веществами, обладающими микробицидным действием и способными при соблюдении определенных режимов воздействия обеспечить полное уничтожение микрофлоры. Химическую стерилизацию обычно применяют для обработки различных приборов и инструментов многоразового использования, чувствительных к высоким температурам (фиброоптические приборы, медицинские имплантаты и др.). К стерилизу ющим агентам относятся окись этилена, перекись водорода, глютаровый альдегид, пероксиуксусная кислота, двуокись хлора. Независимо от метода во всех случаях требуется регулярный контроль эффективности процедуры стерилизации. С этой целью используют биологические индикаторы — известные микроорганизмы, наиболее устойчивые к данному способу обработки (например, споры Bacillus stearothermophilus для контроля эффективности автоклавирования, Bacillus subtilis — для контроля сухожаровой стерилизации). Существуют также физико-химические индикаторы — вещества, которые претерпевают видимые изменения (изменяют цвет, агрегатное состояние и т.д.) только при соблюдении правильного режима обработки. • Методы дезинфекции Для дезинфекции применяют физические и химические методы. I. Физические методы. Воздействие высоких температур. Кипячение. Шприцы, мелкий хирургический инструментарий, предметные и покровные стекла и некоторые другие предметы помещают в стерилизаторы, в которые наливают воду. Для устранения жесткости и повышения температуры кипячения к воде добавляют 1—2 % раствор бикарбоната натрия. Кипячение производят не менее 30 мин. При кипячении некоторые вирусы (например, вирус гепатита В) и споры бактерий сохраняют жизнеспособность. Пастеризация основана на антибактериальном действии температуры в отношении вегетативных клеток, но не бактериальных спор. Нагревание материала производится при температуре 50—65 °С в течение 5—10 мин с последующим быстрым охлаждением. Обычно пастеризуют напитки и пищевые продукты (вино, пиво, соки, молоко и др.). Воздействие ионизирующих излучений. Ультрафиолетовое излучение (УФ) с длиной волны 260—300 мкм обладает достаточно выраженным микробицидным действием, однако некоторые виды микробов и споры резистентны к УФ. Поэтому УФ-облучение не способно обеспечить полного уничтожения микрофлоры — стерилизацию объекта. Обработку УФ обычно используют для частичного обеззараживания (дезинфекции) крупных объектов: поверхностей предметов, помещений, воздуха в медицинских учреждениях, микробиологических лабораториях и т.д. Гамма-излучение обладает выраженным микробицидным действием на большинство микроорганизмов, включая вегетативные формы бактерий и споры большинства видов, грибы, вирусы. Применяют для стерилизации пластиковой посуды и медицинских инструментов одноразового использования. Следует иметь в виду, что обработка гамма-излучением не обеспечивает уничтожения таких инфекционных агентов, как прионы. И. Химические методы. Это обработка объекта дезинфектан-тами — микробицидными химическими веществами. Некоторые из этих соединений могут оказывать токсическое действие на организм человека, поэтому их применяют исключительно для обработки внешних объектов. В качестве дезинфектантов обычно используют перекись водорода, хлорсодержащие соединения (0,1—10 % раствор хлорной извести, 0,5—5 % раствор хлорамина, 0,1—10 % раствор двутретьеосновной соли гипохлората кальция — ДТСГК), формальдегид, фенолы (3—5 % раствор фенола, лизола или карболовой кислоты), йодофоры. Выбор дезинфицирующего вещества и его концентрации зависят от материала, подлежащего дезинфекции. Дезинфекция может быть достаточной процедурой для обеззараживания только таких медицинских инструментов, которые не проникают через естественные барьеры организма (ларингоскопы, цистоскопы, системы для искусственной вентиляции легких). Некоторые вещества (борная кислота, мертиолат, глицерин) применяют как консерванты для приготовления лечебных и диагностических сывороток, вакцин и других препаратов. • Методы антисептики В качестве антисептиков используют только малотоксичные для организма соединения, оказывающие антимикробное действие. Наиболее часто применяют 70 % этиловый спирт, 5 % раствор йода, 0,1 % раствор КМп04, 0,5—1 % спиртовые растворы метиленового синего или бриллиантового зеленого, 0,75—4,0 % раствор хлоргексидина, 1—3 % раствор гексахло-рофена и некоторые другие соединения. Антимикробные вещества добавляют также к материалам, используемым при изготовлении перевязочных средств, лейкопластырей, зубных протезов, пломбировочных материалов и т.п. с целью придания им бактерицидных свойств. Методы контроля эффективности стерилизации, действия антисептических и дезинфицирующих веществ. Изучение антибактериального действия высоких температур. В пробирки с питательным бульоном поместить шелковые нити, смоченные смесью спорообразующей (3 пробирки) и неспорообразующей (3 пробирки) культур. По одной пробирке с каждой культурой подвергнуть автоклавированию или кипячению; контрольные пробирки никакому воздействию не подвергать. После обработки все посевы выдержать в термостате при 37 °С в течение 24 ч. Отметить результат поставленного опыта и сделать заключение. Контроль стерильности перевязочного материала и хирургических инструментов. Проводят посев исследуемых образцов (или смывов с поверхности крупных инструментов) на три среды: сахарный бульон, тиогликолевую среду и жидкую среду Сабуро. Посевы инкубируют в термостате 14 дней. При отсутствии роста во всех посевах материал считают стерильным. Изучение антибактериального действия УФ-лучей. Суспензию стафилококка или E.coli в изотоническом растворе хлорида натрия в объеме 1 мл поместить на расстоянии 10—20 см от центра лампы. Облученную и необлученную (контроль) суспензии бактерий засеять в питательный бульон и инкубировать при 37 °С в течение 16—24 ч, после чего оценить результаты: отсутствие помутнения среды связано с гибелью облученной культуры бактерий, в контроле отмечается помутнение, что свидетельствует о наличии роста. Определение антимикробного действия антисептических и дезинфицирующих средств. 1. Подготовить два вида тест-объектов: а) шелковые нити, смоченные культурой E.coli; б) шелковые нити, смоченные спорообразующей культурой (с большим содержанием спор). Нити поместить в растворы фенола (5 %), лизола (5 %), хлорной извести (10 %) на 5 и 60 мин, после чего отмыть от исследуемых веществ, засеять в питательный бульон и поместить в термостат до следующего дня. Контрольные пробы действию химических веществ не подвергать. Отметить результат поставленного опыта и сделать заключение. 2. Диски из фильтровальной бумаги смочить растворами исследуемых веществ и поместить на поверхность питательного агара в чашке Петри, засеянной (газоном) тест-культурой стафилококка или кишечной палочки. Чашку инкубировать в течение суток при 37 °С. Об антибактериальном действии исследуемых веществ судят по диаметру зон задержки роста бактерий, образующихся вокруг дисков. |
Похожие:
 |
Литература для студентов медицинских вузов акушерство Рекомендовано Департаментом научно-исследовательских и образовательных медицинских учреждений Министерства здравоохранения Российской... |
|
Рабочая программа учебной дисциплины клиническая иммунология и аллергология... Рабочая программа составлена на основании: Программы по микробиологии, вирусологии, иммунологии для лечебных, медико-профильных и... |
|
Рабочая программа учебной дисциплины клиническая иммунология Для... Рабочая программа составлена на основании: Программы по микробиологии, вирусологии, иммунологии для лечебных, медико-профильных и... |
 |
H. В. Прозоркина, П. А. Рубашкина Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии Санитарно-микробиологическое исследование объектов окружающей среды в лечебно-профилактических учреждениях |
|
Литература в библиотеке ми пгу основная литература Детские болезни А. А. Бар Пропедевтика детских болезней Мазурин 2001г 1 шт. – читальный зал Баранова, Г. А. Лыскиной для студентов... |
|
Учебник для студентов медицинских вузов Учебник содержит тестовый контроль знаний по психотерапии и список рекомендуемой литературы. Для студентов медицинских вузов и врачей... |
|
Учебник для вузов Рекомендовано Учебно-методическим объединением... Дудникова Э. В. — профессор кафедры детских болезней по ростовского государственного медицинского университета, доктор медицинских... |
|
Руководство к лабораторным занятиям по гигиене детей и подростков... Учебное пособие предназначено для студентов медицинских вузов по специальности «Лечебное дело» ипрактикующих врачей |
|
Коркина М. В. К66 Психиатрия: Учебник для студ мед вузов / М. В.... Учебник предназначен для студентов медицинских вузов, работающих психиатров, психотерапевтов, медицинских психологов и специалистов... |
|
И стерилизация Рецензенты: доц каф микробиологии, вирусологии и иммунологии, канд мед наук Н. Ф. Казак; зав лабораторией индикации возбудителей... |
|
Неинфекционные заболевания кожи учебно-методические указания к практическим... Зав кафедрой дерматовенерологии гбоу впо «Кубгму» Минздрава России, профессор, д м н |
|
Литература для студентов медицинских вузов (авторы) сборник тестов по биохимии В сборнике представлены тесты по биохимии, составленные в полном соответствии с теоретическим материалом по курсу «Биохимии», рекомендованному... |
|
Практических занятий по медицинской микробиологии Руководство по организации и проведению практических занятий по медицинской микробиологии /Под ред акад. Рамн о. В. Бухарина. Екатеринбург,... |
|
Учебник для медицинских вузов и медицинских специалистов Серия «xxi век» Учебник предназначен для студентов медицинских муювi-ii курсов, продолжающих изучение английского языка |
|
Руководство по статистическому анализу деятельности лечебно-профилактических учреждений Руководство предназначено для руководителей органов и учреждений здравоохранения, врачей всех клинических специальностей, врачей-статистиков... |
|
Руководство состоит из двух частей. Часть первая «Общая онкология» Руководство предназначено для нефрологов, врачей-терапевтов, студентов старших курсов медицинских вузов, а также клинических интернов... |